引物二聚体的形成VIP免费

什么是引物二聚体怎样消除引物二聚体是引物的 3'端间相互错配扩增形成的。 引物二聚体的出现是必然的， 只是或多或少的问题， 电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们 的肉眼看不到而已。提高PCR严谨性 (包括提高退火温度，降低引物浓度等)可大大降低二聚体的浓度。减少 PCR产物中引物二聚体的方法 : 1 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题 ;模板浓度过小，适当加大模板量; 酶，引物， Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度 ; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100 摄氏度下的沸水中煮5 分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的 ;理由 :引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构 ,在 100 摄氏度下的沸水中煮 5 分钟可使引物变为单链， 以减少二聚体。 不过有人认为在PCR仪上 95 度变性 5min 也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配 MIX 中加 5%的甘油或者 5%的 DMSO，可 以增强特异性 ; 反应体系的配制在冰上进行， 最后加 TAq 酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数 ; 8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度 (根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些 ); 9.若降低退火温度， 发现还是只有引物二聚体， 而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer 等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10. 以上次的 PCR产物作模板二次 PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体， 如果两次时间间隔短的话， 可以把原产物稀释100－1000 倍，如果间隔较长可以稀释 50－100 倍。反应成分问题：可能的原因解决办法引物 3’端互补重新设计引物引物长度过短增大引物长度引物浓度太高降低引物浓度模板浓度太低提高模板浓度反应条件问题：可能的原因解决办法退火温度不够优化优化退火温度循环数太多减少循环数如何区分引物二聚体与PCR产物（ 100kb）（1）． PCR产物的电泳检测可能出现那些问题：一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，...