PCR技术的原理操作及应用解读VIP免费

PCR技术的原理、操作及应用PCR技术的原理、操作及应用西南大学生命科学学院范迪2013.04.11分子生物学什么是PCRPCR:PolymeraseChainReaction，即聚合酶链式反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的发展历史1985关于PCR的文章首次由美国科学家KaryMullis等人在《Science》杂志上发表1989《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理1遗传物质：细胞核染色体DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。DNA双螺旋结构和遗传密码子的发现，开创了分子生物学的时代。PCR技术的原理2A—TG—CAAA-TA-TA—TC—GC—GG—CG—CA—TTTA—TG—CC—GA-TA-TA—TC—GG—CG—CA-TA—TG—CT—AC—GT—AA-TA-TA—TC—GG—CG-C基本原理DNA的半保留复制原则碱基互补配对原则A=T，G=CPCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR技术的原理3PCR反应的体系包括7种基本成分：模板（TemplateDNA）引物（Primer）TaqDNA聚合酶dNTPTaq聚合酶缓冲液（TaqBuffer）PCR技术的原理4基本反应步骤：变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位延伸(extension)-Taq酶作用下，不断向引物3’端添加dNTP，DNA链不断延伸PCR技术的原理51234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍以温度变化来控制反应阶段PCR技术的优点优点:特异灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU简便、快速、自动化1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR技术的局限性为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。PCR技术扩增产物的长度有限。标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液5ul模板DNA0.1～2ug引物各10～100pmol4种dNTP混合物各200umol/LTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L加双蒸水至50ul可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可PCR循环参数94℃，3min；94℃，45s；58℃，1min；72℃，1min；循环30次72℃，10min；16℃保温（热力学参数）94℃，3min；94℃，45s；58℃，1min；循环30次72℃，1min；72℃，10min；16℃保温94℃预变性，3min使DNA双链完全打开退火：58℃，1min温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。变性：94℃变性，45s使双链DNA解链为单链延伸：72℃，1min温度为Taq酶最适反应温度72℃时间由扩增片段的长度决定1min扩增1KBPCR扩增产物检测1凝胶电泳缓冲液配方10×TBE缓冲液(每升)：Tris107.8gBoricAcid55.0gEDTA(Na2)8.2g10×TAE缓冲液(每升)：Tris48.4g冰乙酸11.42g0.5mol/LEDTA20ml用电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶，按每孔8ulPCR产物上样至胶中。100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。PCR扩增产物检测2PCR扩增产物检测及结果判定PCR技术的注意事项防止污染，建立良好的质量控制，避免污染。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环镁离子浓度对反应效率的影响仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等设置对照：PCR反...