PCR技术及其应用解析VIP免费

第八章PCR技术及其应用前言PCR技术简史第一节PCR技术原理和工作方式第二节PCR产物的克隆第三节PCR扩增未知DNA片段第四节与反转录相关的PCR第五节PCR产生DNA指纹第六节实时定量PCR本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第一节PCR技术原理和工作方式DenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。24/10/19西南大学生物技术专业基因工程71缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。厂商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。。二、PCR反应体系24/10/19西南大学生物技术专业基因工程82、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓度为0.2mmol/L左右。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。24/10/19西南大学生物技术专业基因工程9PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。精确的Tm计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的动力学参数。3、引物一般溶成10mol/L的贮存液，使用浓度为0.1-0.5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。24/10/19西南大学生物技术专业基因工程103.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。4.要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高，但3’要避免较密的C+C或G+C连排。7.引物5’末端碱基可...