UNG 酶在 PCR 中的作用 UNG 酶 Uracil-N-glycosylase 尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶 原理:UNG 酶的作用原理是选择性水解断裂含有 dU 的双链或单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键,形成的有缺失硷基的 DNA 链在硷性介质,高温下会进一步水解断裂,从而被消除.UNG酶的最佳活性温度为 50℃,95℃灭活。 作用:为保证 PCR 结果的准确性,要预防非特异性 PCR 扩增和污染。常用的措施是使用 UNG 酶(Uracil-N-Glycosylase)和 Taq 酶热启动。PCR 反应最常见, 最重要的污染物是 PCR产物,防污染热启动 PCR 试剂盒以 dUTP 取代 dTTP,所以 PCR 产物都是含有 dU 的 DNA链。在 PCR 开始前增加 50℃的保温步骤,UNG 酶即可将反应体系中已有的 U-DNA 污染物中的尿嘧啶硷基降解,并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂,消除由于污染 DNA 产生的扩增,从而保证扩增结果的特异性,准确性。同时 UNG 酶被灭活,不会再降解新扩增的产物 U-DNA。 高品质的 UNG 酶可以消除高达 108 的 U-DNA 产物,和热启动 Taq 酶一同用于建立含有 UNG/dUTP 防污染体系的热启动 PCR 反应系统。 UNG 酶特征 • 克隆有 Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱导表达后,再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。分子量25.66 KDa。 • 反应条件: 50 ℃ ,2 分钟;反应 buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。 尿嘧啶糖苷酶(UNG)法 由于 UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好,而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右,因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理:在 PCR 产物或引物中用 dU 代替dT。这种dU 化的 PCR 产物与UNG 一起孵育,因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键,可除去dU 而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链 DNA 中消除尿嘧啶,而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP 法:用 dUTP 代替dTTP,使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前,用 UNG处理 PCR 混合液即可消除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含 dU 的新的 PCR 产物。3. dU 引物法:合成引物时以 dU 代 dT,这样PCR 产物中仅5ˊ端带 dU。UNG 处理后,引物失去了结合位...