二代测序（WGS&WES）文库构建流程介绍韩丽萍2019.4.12目录01基本概念介绍04疑问与讨论02基础文库构建WGS文库&WES预文库03杂交捕获技术WES文库01基本概念介绍基本概念介绍全基因组重测序（Whole-Genomesequencing,WGS）是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。外显子组测序（Whole-exomesequencing,WES）是利用设计好的探针将坐标已知的全基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后，进行高通量测序的基因组分析方法。对于人类基因组来说，外显子区域大概占到基因组的1%，大概在30M左右。一般WES的测序深度为50X~200X，具体深度依研究目的而定，其中个体之间的变异程度较WGS小。ReadsinIGVIntegrativeGenomicsViewer(IGV)是一款针对高通量测序数据进行可视化的专业软件。它支持各种数据类型，包括基于芯片测序、二代测序和基因组注释数据等。可以帮助用户对分析结果中的相关文件在可视化的条件下进行浏览分析。02基础文库构建文库分子模型随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检随机打断WGS:300-400bpWES:150-250bp随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检末端修复5’末端磷酸化5’5’3’3’PP聚合补平5’5’3’3’5’5’3’3’外切削平5’5’3’3’5’5’3’3’随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检5’5’3’3’PP5’5’3’3’AAPP加A随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检IndexedAdaptorGeneralAdaptor随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检扩增扩增P5、P7引物P5端通用引物（一种）P7端含有index的引物（多种）通过加接头引入index通过PCR扩增引入index随机打断DNA末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检末端修复3’端加A（dATP）加接头PCR扩增OnPCR磁珠纯化与片段分选片段分选第二步去掉小片段片段分选第一步去掉大片段03杂交捕获技术液相杂交捕获技术介绍利用寡核苷酸序列合成技术，合成大量生物素标记的RNA/DNA“诱饵”，利用碱基配对原理，通过生物素与链霉亲和素的结合将目标区域进行富集的技术。常用的液相杂交捕获试剂主要有Agilent、Roche和illumina，国内的主要是艾吉泰康。◆封闭与杂交：（预文库/Blockingoligos）+[杂交捕获液/生物素标记探针/RNAase抑制剂]。95度变性解链，65度退火复性，杂交16-24h。生物素标记的探针（RNA,120~nt）Cot-1blocker接头blocker外显子Cot-1重复序列接头封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检◆捕获与洗脱1、磁珠上的链霉亲和素与探针上的生物素结合（常温反应30min）。封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检Complex◆捕获与洗脱2、含有Complex的离心管放置到磁力架上等液体澄清以后，将上清去除即可去除“多余或未利用的Blockingoligos”“”、生物素标记探针以及杂交捕获液。3、65度条件下进行洗脱，去除非特异性片段。封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检杂交、捕获与扩增-1杂交、捕获与扩增-2杂交、捕获与扩增-3质量浓度：ng/ul文库长度：bp文库实际有效浓度：摩尔浓度封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检估算文库摩尔浓度04疑问与讨论
