分子诊断概览2018年重庆市临床基因扩增检验实验室技术人员上岗培训班资料分享主要内容•1、分子病理实验室设置与工作制度•2、基础知识•3、核酸提取与纯化•4、基因扩增分子实验室设置和工作制度•标本接收区•试剂储存和准备区•样本制备区•扩增区•扩增产物分析区•各区独立，注意空气流通方向及气压。•进入各区域严格按照单一方向。•各区域必须有明确标记，设备、物品不得混用。•各区域使用专用工装服、清洁用具。•工作结束后，必须对工作区清洁。•所有操作符合《实验室生物安全通用要求》。试剂储存和准备区•储存试剂•试剂分装•反应混合液准备•离心管储存准备•吸头储存准备•消耗品准备•冰箱（冷藏、冷冻）•高速离心机•混匀器•超净工作台•微量加样器•可移动紫外灯•一次性耗材•专用防护用品样本制备区•核酸提取•核酸储存•加入反应管•冰箱（冷藏、冷冻）•高速离心机•混匀器•水浴箱或加热模块•微量加样器•可移动紫外灯•生物安全柜•一次性耗材•专用防护用品扩增区•cDNA合成•DNA扩增•检测•核酸扩增仪•微量加样器•可移动紫外灯•一次性耗材•专用防护用品扩增产物分析区•杂交•酶切电泳•变性高效液相分析•测序•微量加样器•可移动紫外灯•一次性耗材•专用防护用品基础知识•核酸•以核苷酸（碱基）为基本组成单位的生物信息大分子。•结构•磷酸基团及戊糖构成骨架•碱基序列编码遗传信息•理化性质•强烈的紫外吸收。•线性高分子化合物，粘度极大。•多元酸，较强酸性。•脱氧核糖核酸（DNA）•90%以上分布于细胞核，其余分布于线粒体、质粒、叶绿体等。携带遗传信息，决定基因型。•核糖核酸（RNA）•分布于细胞核、细胞浆。部分病毒的RNA也可作为遗传信息载体。基础知识•OD260/OD280•紫外光波长260nm及280nm吸光光度（光密度）比值。•OD260代表核酸吸光度。•OD280代表蛋白质吸光度。•OD260=1.0•50ug/ml双链DNA•40ug/ml单链DNA(RNA)•20ug/ml寡核苷酸•核酸样品纯度•OD260/OD280•=1.8：纯DNA•=2.0：纯RNA•1.8-1.9：DNA居多•1.9-2.0：RNA居多基础知识•DNA变性•在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。•原理：NDA双链间氢键断裂。A2T，C3G。•方法：过量酸，碱，加热，变性试剂（尿素、酰胺、乙醇、丙酮等）。•性质变化：OD260增高，粘度下降，比旋度下降，酸碱滴定曲线改变。•Tm值•熔解温度、解链温度（Tm）：DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值（OD260）达到最大值50%时的温度。•影响因素：DNA均一性，CG含量，介质中离子强度。基础知识•DNA复性•适当条件下，变性DNA的两条互补链恢复天然的双螺旋构象。•热变性的DNA经缓慢冷却而复性，称退火。•增色效应：变性时OD260增高。•减色效应：复性时OD260降低。•CT值•PCR扩增过程中，指数增长期（15-25周期）内，荧光信号强度超过基准期（1-15周期）10倍时的循环周期数。•特点：同一模板CT值极具重现性；与模板DNA量正相关。基础知识•主流技术•分子杂交•基因扩增•核酸测序•应用方向•感染性疾病•遗传性疾病•肿瘤性疾病•药敏及耐药检测•优生优育•易感性预测分子杂交•在复性过程中，以标记的DNA单链或RNA（探针）与被检DNA或RNA放入同一溶液中，如果两种单链分子存在一定的碱基配对关系，形成被标记的双链。•DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA。•根据探针标记物种类及其检测方式。•荧光原位杂交（FISH）•银染原位杂交（SISH）•地高辛HRP-DAB原位杂交•链霉亲和素HRP-TMB点杂交•。。。基因扩增•在一定条件下，以核酸的碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板（目标）DNA链互补的半保留复制链。•靶基因扩增：•PCR（聚合酶链式反应）•TAS（转录依赖的扩增）•LCR（连接酶链式反应）•探针扩增：•Qβ复制酶系统•信号扩增/放大：•bDNA核酸测序测定核酸链碱基排列顺序。•第一代•sanger（DNA聚合酶）•454焦磷酸（DNA聚合酶）•第二代•Solexa（DNA聚合酶）•SOLID（DNA连接酶）•第三代•SMS（DNA聚合酶）•SMRT（DNA聚合酶）•纳米孔单分子（核酸外切酶）•IonTorren6（合成测序）•第四代•固态纳米...
