基因文库的构建与筛选VIP免费

第六章基因文库的构建与筛选GenelibrariesandscreeningGenomiclibraries——基因组文库cDNAlibraries——cDNA文库Screeningprocedures——筛选流程基因文库概念和分类Genelibraries：来自某种生物的不同DNA序列的总集，这些DNA序列已经被克隆在载体上，以便于纯化、贮存和分析。GenomiclibrariescDNAlibrariesGenelibraries(madefromgenomicDNA)(madefromcDNA-copyofmRNA)（基因组文库）（cDNA文库）(根据来源不同)1、Genomiclibraries基因文库的代表性（Representativegenelibraries）文库大小（Sizeoflibrary）基因组文库的构建（GenomicDNA）载体（Vectors）文库的代表性代表性是指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。原始序列可能缺失的原因：1.特定的序列未被克隆2.文库中克隆子的数目不足文库大小（保证文库中包含足够的克隆）为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon于1975年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值Forexample:我们期望目的基因在文库中出现的概率为0.99，克隆平均插入的片段大小为20kb，计算Ecoli(4.6×106bp)和人类基因组(3×109bp)文库应包含的克隆数。ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]NEcoli==1.1×103Nhuman==6.9×105ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]基因组文库的构建BreakDNAintofragmentsrandomlyEukaryotesProkaryotesClonethesefragmentsintovectors（将片段克隆入载体）真核生物原核生物(纯化基因组DNA)(随机切割DNA)PurifygenomicDNA纯化基因组DNA：真核生物——细胞分级分离法：破裂细胞，去除蛋白质、脂类、次生代谢物、其他生物大分子原核生物：直接抽提随机切割DNA：物理剪切：吹打、震荡、超声波限制性内切酶切割：部分酶切可产生较大片段的DNA限制性内切酶的选择：1、酶切产生的末端是否能和载体直接相连？2、酶的作用是否被DNA碱基修饰作用所抑制？3、酶解的时间影响最后产生的目的片段的大小？载体的选择根据基因组的大小来选择合适的克隆载体。根据特征，构建基因组文库的载体可以分为两类，一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段。VectorsPlasmidphageλcosmidYACinsert(kb)523451000常用的基因组克隆载体λrelacementvectors（替换型）BAC文库的构建流程图2、cDNA文库cDNA文库对于真核生物的基因分析非常有用！1）cDNA从mRNA逆转录而来，代表了基因中的可转录部分（去除了非转录序列）2）cDNAs不含有内含子（intronsequences），可以直接在大肠杆菌中表达3）可以用于鉴定新基因4）不同类型的细胞和组织表达特定的基因（奢侈基因）NocDNAlibrarywasmadefromprokaryoticmRNA!•原核的mRNA不稳定•原核的基因组文库更容易制备，并且可以包含所有的基因组序列cDNA文库构建流程mRNAisolation、purificationChecktheRNAintegrityFractionateandenrichmRNASynthesisofcDNATreatmentofcDNAendsLigationtovectorGenelibrariesandscreeningmRNA的提取、纯化mRNA的分级分离、富集合成cDNA与载体连接cDNA的末端处理检测mRNA的完整性1）mRNA的分离1.传统的提取方法是把总RNA通过寡聚(dT)-纤维素柱。2.直接将结合了寡聚(dT)的磁珠加入到细胞裂解液中，利用磁性将吸附了mRNA的磁珠分离出来后，再用溶剂把mRNA从磁珠上洗脱。3.利用蔗糖梯度，从细胞裂解液中制备mRNA－核糖体复合物，再提取mRNA。2）检查mRNA的完整性MakesurethatthemRNAisnotdegraded.（确定mRNA没有被降解）Methods:TranslatingthemRNA（翻译mRNA）AnalysisthemRNAsbygelelctrophoresis（琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳）3）克隆特定的mRNA为了克隆某一特定基因，而不是构建完整的cDNA文库，需要对mRNA进行分级分离或者富集。...