细胞免疫组化 细胞爬片的免疫组化 1.细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。 2. PBS 清洗标本 3 次 各 1 min。 3 .冰丙酮固定 15 min(或4%多聚甲醛固定30min)。 4. 空气干燥 5min。 5. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 6. 0.5%Triton X-100( DPBS 配 ) 孵育 1 次 20min。 7. PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 8 .3%H2O2（试剂A）孵育 15 min。 9. DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 10. 封闭血清孵育（试剂B） 20min。 11 .一抗孵育（滴度1：200，湿盒）4℃ 过夜或37℃60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS 液 12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 13 .二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 37℃30 min。 14 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 15. 试剂D（湿盒） 37℃ 30 min。 16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约 3~ 10min。 18、蒸馏水洗 2 次 1 min。 19、苏木素复染 0.5~ 1min。 20、自来水洗返蓝。 21.梯度酒精脱水 75，85，95，100%各 3min。 22.二甲苯透明 2 次 3min。 23、中性树胶封片。 注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下： a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达 5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片； b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜，若密度太高 5 天后细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片） 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？ 1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。 如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24 孔，或6 孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。 2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。 细胞爬片固定后粘到载玻片...
