细胞凋亡的检测方法VIP专享VIP免费

细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 1、细胞凋亡的形态学检测：根据凋亡细胞固有的形态学特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 a、光学显微镜和倒置显微镜观察：未染色凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；染色凋亡细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 b、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况，常用的 DNA 特异性染料有：有 HO 33342（Hoechst33342）,HO 33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释成终浓度一般为2-5ug/ml。DAPI 为半通透性，用常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水溶解为浓度1mg/ml，使用终浓度一般为0.5-1ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb 期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 c、透射电子显微镜观察。结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyllserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在凋亡早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种分子量为35-36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidine iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin...