细胞的冻存和复苏 2007-07-20 点击: 179 本文共1 篇文章 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞
二、操作步骤 （一）冻存 1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中
2、1000rpm 离心 10 分钟，弃上清液
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至 5× 106/ml 左右
4、将悬液分至冻存管中，每管 1 ml
5、将冻存管口封严
如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期
冻存管外拴一金属重物和一细绳
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20 分钟〕→冰箱冷冻室（30 分钟）→低温冰箱（－30℃ 1 小时）→气态氮（30 分钟）→液氮
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤
液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般 30 立升的液氮能用 1～1
（二）复苏 1、准备一个茶缸或 1000ml 的烧坏，内装 2/3 杯 37℃的温水
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动
使冻存管中的冻存物在1 分钟之内融化
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中
4、1000rpm 离心 10 分钟，弃去上清液
5、沉淀加10ml 培养液，吹打均匀，再离心 10 分钟，弃上清液
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37
