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细胞的冻存和复苏VIP免费

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细胞的冻存和复苏 2007-07-20 点击: 179 本文共1 篇文章 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。 二、操作步骤 (一)冻存 1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm 离心 10 分钟,弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至 5× 106/ml 左右。 4、将悬液分至冻存管中,每管 1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温:室温→4℃(20 分钟〕→冰箱冷冻室(30 分钟)→低温冰箱(-30℃ 1 小时)→气态氮(30 分钟)→液氮。 注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,绝对不能挥发干净,一般 30 立升的液氮能用 1~1.5 月。 (二)复苏 1、准备一个茶缸或 1000ml 的烧坏,内装 2/3 杯 37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1 分钟之内融化。 3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。 4、1000rpm 离心 10 分钟,弃去上清液。 5、沉淀加10ml 培养液,吹打均匀,再离心 10 分钟,弃上清液。 6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。 三、试剂和器材 器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等 试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液) 附:冻存液配制: 培养基加入甘油或 DSMO,使其终浓度达 5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后 4℃下保存。 细胞的传代培养 2007-07-20 点击: 232 本文共 1 篇文章 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细...

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