免疫实验人外周血单核细胞分离VIP免费

免疫学实验课免疫学实验课外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离实验内容实验内容外周血单个核细胞的分离（实验）外周血单个核细胞的分离（实验）淋巴细胞分离及检测技术（讲解）淋巴细胞分离及检测技术（讲解）实验目的实验目的掌握单个核细胞分离及淋转的原理和方法掌握单个核细胞分离及淋转的原理和方法熟悉淋巴细胞的检测技术熟悉淋巴细胞的检测技术细胞分离纯化的目的细胞分离纯化的目的测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取组织中获取有活性有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。胞、粒细胞等。根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑虑(1)(1)细胞细胞纯度纯度；；(2)(2)细胞细胞获得量获得量；；(3)(3)细胞细胞活活力力；；FicollFicoll密度梯度离心法密度梯度离心法常用来分离外周血单个核细胞（常用来分离外周血单个核细胞（PBMCPBMC）的分层液：比重）的分层液：比重是是1.0771.077左右的聚蔗糖左右的聚蔗糖(Ficoll)-(Ficoll)-泛影葡胺泛影葡胺(Urografin)(Urografin)分层液。分层液。红细胞、粒细胞比重大红细胞、粒细胞比重大((1.0921.092))，离心后沉于管底；淋巴，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重((1.0701.070))，，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。就可从外周血中分离到单个核细胞。比重：1.070比重：1.077比重：1.092FicollFicollFicoll密度梯度离心法密度梯度离心法实验材料实验材料分组：两人一组分组：两人一组器材器材数量数量试剂试剂数量数量滴管滴管22支支/2/2人人分层液分层液1ml/21ml/2人人EPEP管管11个个/2/2人人血液血液1ml/21ml/2人人计数板计数板11块块/2/2人人PBSPBS11瓶瓶/4/4人人1ml1ml刻度吸管刻度吸管11支支/4/4人人计数液计数液11管管/4/4人人加样器加样器(tip)(tip)11把把/4/4人人显微镜显微镜11台台/4/4人人实验步骤实验步骤1.1.加样：加样：吸取吸取1ml1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部；稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部；NOTENOTE：：不要打破血液与分层液的界面；不要打破血液与分层液的界面；2.2.分离：分离：2,000r/min2,000r/min离心离心15min15min，离心后管内液体可分为四，离心后管内液体可分为四层，见后图；层，见后图；3.3.回收：回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入个核细胞，放入EPEP管中，管中，400400ll左右即可；左右即可；NOTENOTE：尽量少吸分层液；：尽量少吸分层液；4.4.计数：计数：将将EPEP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出管中的细胞液上下颠倒混匀，取出2020ll加入加入新的新的EPEP管中，再加入管中，再加入2020ll细胞计数液，混匀后取出细胞计数液，混匀后取出1010ll，，加到计数板内，显微镜下计数。加到计数板内，显微镜下计数。示意图示意图细胞计数方法细胞计数方法查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数4显微镜下活细胞形态显微镜下活细胞形态淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞分离及检测技术巨噬细胞淋巴细胞DCDC细胞细胞DCDC细胞细胞红细胞淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞分离淋巴细胞分离一、外周血单个核细胞的分离淋巴细胞分离液密度梯度离心法二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定1.E花环分离法2.尼龙纤维分离法3.流式细胞术4.磁珠分离术EE花环分离法花环分离法（纯化（纯化TT细胞）细胞）TT细胞表面的细胞表面的CD2CD2分子－绵羊红细胞受体（分子－绵羊红细胞受体（EE受体）受体）尼龙纤维分离法BB细胞和...