实验三：单克隆抗体的制备实验三：单克隆抗体的制备实验目的和要求了解单克隆抗体的特性和优缺点；学会在实验室制备针对某种抗原表位的单克隆抗体。单克隆抗体的制备原理单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。1975年Khler和Milstein首次建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术，即单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。单克隆抗体技术：用人工方法将产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又有B细胞分泌特异性抗体的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内可获得大量高效价、单一的特异性抗体，即McAbHAT选择性培养基：培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine(H)，氨基蝶呤Aminoopterin(A)，胸腺嘧啶核苷Thymidine(T)]；酶：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷合成NDA氨基蝶呤：阻断谷酰胺与鸟核苷酸单磷酸合成DNA结果：未融合的瘤细胞不能合成DNA，必然死亡。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于2周内死亡。融合的杂交瘤细胞由于淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基蝶呤的阻断，因此可以大量繁殖而被筛选出来实验材料实验动物为纯系Balb/c小鼠，细胞为骨髓瘤细胞SP2/0;含有一定表位的抗原；10%DMEM培养液；HAT选择性培养基；HT选择性培养基；融合剂为PEG2000；兔抗鼠IgG酶标抗体；台盼蓝溶液；细胞培养板及常规细胞培养用试剂和器材。具体操作方法抗原准备：颗粒性抗原（肿瘤细胞、细菌），可溶性抗原（多糖、药物）小鼠免疫：免疫间隔一般为2～3周，末次免疫后3～4天，可分离脾细胞融合。（一）抗原准备及小鼠免疫将PEDVS2基因克隆表达后作为免疫原免小鼠MS1S1—S2S2—以PEDVcDNA为模板扩增S2片段转化后菌液PCR鉴定M12345678+—送测序确定序列后再诱导表达6P-1S2MS2的SDS-Page结果图（二）细胞悬液的制备骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。目前常用的小鼠骨髓瘤细胞系为SP2/0。免疫小鼠脾细胞的制备饲养细胞的制备常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞。在制备饲养细胞时，切记针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。（三）细胞融合诱导细胞融合的方法：生物学方法（仙台病毒）、物理学方法（电场诱导、激光诱导等）、化学方法以及受体指引型细胞融合法。目前最常用的方法是聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）法，即把骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合后加入聚乙二醇（PEG），使两种细胞彼此融合，再通过稀释的方法消除PEG的毒性作用。聚乙二醇介导的细胞融合（四）融合后混合细胞的培养随机融合后的细胞类型采用HAT培养液选择培养1.换液（半量换液）2.观察细胞类型HGPRT生长状态淋巴细胞+骨髓瘤细胞+长期生长淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞-不能生长未融合淋巴细胞+短期生长未融合骨髓瘤细胞-不能生长（五）阳性杂交瘤细胞的克隆筛选杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此必须进行筛选和克隆化。克隆化可选择的方法有液相有限稀释法、软琼脂平板法、显微镜操作法及应用荧光激活细胞分离仪等，其中最常用的是液相有限稀释法及软琼脂平板法。（六）杂交瘤细胞的保存与复苏冻存：慢冻，分步冻存室温-20℃-80℃液氮复苏：快融，取出后立即放入37℃水浴锅中，使其迅速融化。意义：防止细胞污染或是产生抗体的能力丧失（七）单克隆抗体的制备体外培养:悬浮培养系统、固定化培养系统生产量低体内诱生1.腹水型McAb的制备2.血清型McAb的制备（八）单克隆抗体的纯化般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可...
