新城疫新城疫HIHI抗体监测抗体监测新城疫新城疫HIHI抗体监测抗体监测王晓泉刘慧谋新城疫（newcastledisease,ND）是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24小时，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。高架上养鸡的肉鸡场工厂化笼养蛋鸡场一．实验目的二．实验原理三．实验材料四．实验步骤和方法一、实验目的掌握新城疫的免疫监测技术病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素蛋白，能与各种动物的红细胞表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。二、实验原理96孔V型微量反应板、微量振荡器、病毒材料、红细胞悬液、生理盐水或PBS、微量移液器、注射器、抗凝剂、离心机、恒温箱等。三、实验材料1.血清样品的采集、运送和保存2.制备鸡红细胞悬液3.病毒的红细胞凝集试验（HA）4.病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）四、实验步骤和方法1、血清样品的采集、运送和保存（1）血清样品的采集颈静脉或翅静脉采血１ml左右。每个鸡群随机采集30-50份样品。（2）样品的运送和保存样品采集后应立即送到实验室，如实验室距离较远或一时无法立即传送时，应将样品放入冰箱4℃或装有冰块的冰壶内，尽快送检。最好在样品采取后1~2h内送到实验室，立即进行分离血清，尽快检测。暂时不能检测时，应将样品存放在-20℃低温冰箱内保存。*注：也可采集卵黄样品(卵黄：PBS：氯仿=1：1：2)翅静脉采血2、制备鸡红细胞悬液（1）制备1%鸡红细胞悬液：A.用注射器抽取抗凝剂。B.上述注射器，无菌抽取健康的3只未免疫成年鸡的血，与抗凝剂4:1混合。C.混匀，加生理盐水或PBS适量，洗涤离心，共离心5次洗去血清及白细胞。D.所余的纯红细胞压积，用生理盐水或PBS稀释100倍，即成1%的鸡红细胞悬液,4℃保存。3、病毒的红细胞凝集试验（HA）（1）凝集价的测定（2）HA方法与步骤（3）判定结果（1）凝集价的测定将已知病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行HA试验，出现血凝现象的各稀释孔中，能使红细胞完全凝集的病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价。又称为该病毒的血凝滴度。4单位病毒即将一个血凝单位的稀释度增加4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4=16倍稀释。孔号123…….1011对照病毒稀释倍数212223…….210211生理盐水或PBS252525……..252525病毒（已知）252525……..2525弃去25生理盐水或PBS252525……..2525251%红细胞悬液252525……..252525振荡混匀，室温或37℃温箱作用，10分钟开始观察，直到结果出现（2）HA方法与步骤(μL)（3）判定结果：（＋）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的复满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。（－）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。4、病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）（1）凝集抑制价的测定（2）HI方法与步骤（3）判定结果（1）凝集抑制价的测定HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体效价。又称该血清的HI滴度。鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。孔号123…….10对照对照血清稀释倍数212223…….210生理盐水或PBS252525……..252525血清（待检）252525……..25弃去254单位病毒252525……..252525PBS振荡混匀，室温或37℃温箱10分钟1%红细胞悬液252525……..252525振荡混匀，室温或37℃温箱作用，10分钟开始观察，直到结果出现（2）HI方法与步骤(μL)（3）判定结果（＋）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的覆满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。（－）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。结果分析HI平均滴度在26以上鸡群保护率可达90%以上，24以下保护率只有50%左右。如果鸡群中有10%的鸡出现211或者更高的抗体水平，则表明该鸡群发生了新城疫强毒感染。
