microRNA检测方法VIP免费

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子 RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA 广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为 20～24nt。成熟的 miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约 70～90nt 的单链 RNA前体经过 Dicer 酶加工后形成。成熟的 miRNA 形成 RNA 诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点 mRNA，通过对 mRNA 剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。目前人们还不明确 miRNA 及其靶 mRNA 之间的作用机制。 最近有研究指出，miRNA 在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA 参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定 miRNA。 目前检测 miRNA 的方法主要有 Northern 印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。 1、Northern 印迹分析（Northern Analysis） Northern 印迹是基于杂交检测 RNA 的常用方法，它是最早用于 miRNA 分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。 不足之处： 1）Northern 分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条 miRNA 探针与一个 RNA 印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究 miRNA 功能机理的实验中，Northern 印迹分析还是能够满足研究需要的。 2）Northern 印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的 miRNA 分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测 40,000 个 miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测 10 个 miRNA 分子每细胞。另外，由于Northern 印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的 miRNA。例如，同一个家族中的 miRNA let-7c 与 let-7a 和 let-7b 之间仅有一个碱基的差异，导致 Northern 印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern 印迹实验的重复性较弱。 3）Northern 印迹耗时，耗量。进行一次 miRNA 检测需要 3 个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散...