miRNA 常用实验方法 一、 miRNA 的检测方法 miRNA 的realtime-PCR 检测方法 1、 realtime-PCR 引物设计 miRNA realtime-PCR 引物设计方法： 1）stem-loop RT 引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA 序列修改最末端6 个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6 个碱基的反向互补序列，即 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2）realtime 上游引物设计：miRNA 序列除去 3’端6 个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1 的上游引物为(注意把 U 改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm 值（一般参考DNAMAN），如果 Tm 值较低，则在5’端加 GC 使 Tm 值接近 60 度。因此 miR-1 的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4 度。 3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。 4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将 PCR 产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。 2、 miRNA 反转录 miRNA 的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是 TIANGEN 的MLV，逆转录体系为： RNA 500ng~2ug 5xbuffer 2ul dNTP 0.25ul DDT 0.25ul RRI 0.25ul MLV 0.25ul RT primer 0.5ul H2O(RNase free) 补至10ul 程序为（PCR 仪中通常命名为CTFRT）16 度，30min；42 度，60min；85 度，5min；4 度，hold。 ！！做 miRNA 的反转录时，注意不要忘记内参的RT，即一个样品至少要做目的miRNA 和内参两管反转录反应。 3、 realtime-PCR 实验 miRNA 逆转录完成后得到的cDNA 即可进行下一步PCR。在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要3 个平行孔 。Realtime PCR 体系为（ABI 定 量 PCR 仪 需要加 ROX dye II， Biorad 定 量 PCR 仪不需要加 ROX）： 2X SYBR 10 ul ROX II 0.4ul （Biorad 不加） Primer 1ul Template 1ul H2O 7.6ul （ Biorad 8ul） 需 要 注 意 的 几 点 ： 1） 在 配 制 PCR 体 系 时 ， 请 一 定 配 制 总 体 系 ， 逐 步 分 装 。 每 步 ...
