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《分子生物学》实验指导(20152016)VIP免费

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1 《分子生物学》实验指导 实验 1 总 DNA 提取 生物总 DNA 的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同,而细胞壁结构的破坏是提取总 DNA 的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异,因此不同生物采用的提取方法也不同,一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用 CTAB 法提取植物总 DNA 的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习 CTAB 法提取植物总 DNA 的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定 DNA 的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如 CTAB),可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA 进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用 CTAB 法,其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB 的处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的 DNA 样品 A260/280≈1.8,纯的 RNA 样品 A260/280≈2.0,并且 1μg/ml DNA溶液 A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶(50ml)9、滴管 10、细玻棒 11、小烧杯(50ml)12、离心管(50ml)13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer(pH8.0) 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE 缓冲液(pH8.0) 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V) 4、95%乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取 2g 新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成 1cm 长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后,加入 15mL 预热(60℃)的 CTAB 提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中, 2 置于65℃水浴保温 0....

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