多糖的分离纯化VIP免费

莼菜多糖的分离纯化PPT制作：丁楚蔚、汪心妍汇报人：丁楚蔚背景资料：谭晓菁、江淑华研究背景实验步骤与结果总结与展望目录研究背景1莼菜•睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草，•有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等功效，•含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及微量元素，•多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。方法流程采用碱提醇沉工艺，经除蛋白、除色素得到莼菜多糖(BSP)再经DEAE纤维素DE-52柱SepharoseCL-6B琼脂糖凝胶柱对BSP进行分级精制采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)测定BSP各组分的分子量仪器与材料仪器材料Agilent1200HPLC色谱仪AE240分析天平UV-2102PC紫外可见分光光度计FD-1C-55冻干机旋转蒸发仪超滤仪DZG-6020减压干燥箱莼菜嫩叶；无水乙醇；NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺树脂；DEAE纤维素DE-52；琼脂糖凝胶SepharoseCL-6B；透析袋；蒽酮、硫酸；纯化水粗多糖的提取莼菜粗多糖加40倍0.3mol/LNaOH溶液，70℃加热搅拌提取2h，加盐酸中和，过滤，滤液浓缩，加入无水乙醇至67%，4℃静置过夜，4500r/min离心20min，80%乙醇洗涤3次，沉淀减压干燥，得83g莼菜粗多糖。除去脂溶性成分取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇2.5L，60℃旋转回流提取2h，过滤，重复操作1次，除去脂溶性成分，滤渣烘干。莼菜喷干粉新鲜莼菜嫩叶，经清水淋洗、均浆机剪切、喷雾干燥得莼菜喷干粉。粗多糖纯化01020304酶解灭活脱蛋白粗多糖用2.5L纯化水复溶，加入木瓜蛋白酶，63℃酶解6h，灭活过滤除去不溶物，滤液进行第2次酶解灭活脱蛋白。聚酰胺层析滤液流经预处理的聚酰胺层析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填料的体积之比为1∶1，纯化水洗脱，共收集洗脱液8L。滤膜过滤浓缩再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤浓缩至800mL后加入无水乙醇至67%，4℃静置过夜后离心，80%乙醇洗涤3次，减压干燥。得到BSP获得灰白色胶状莼菜多糖(BSP)22g，收率为8.8%。BSP含有量测定010203葡萄糖标准曲线制作BSP纯度测定精密称取干燥至恒重的BSP24.72mg至500mL量瓶，纯化水溶解并定容，摇匀，测定样品吸光度为0.521，计算可知BSP的纯度为61.89%。紫外检测粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋白、聚酰胺脱色素等处理后，紫外全波长扫描显示在260、280nm处其吸光度接近于零，表明已除去蛋白质、核酸等杂质。利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)得曲线方程A=17.294X－0.0076(Ｒ2=0.9994)。BSP精制取10gBSP，200mL纯化水充分溶解后过DEDA纤维素DE-52离子交换柱(60mm×950mm)，依次用0～1.0mol/LNaCl溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用“2.2”项下方法，以洗脱管数为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。BSP经DEAE纤维素DE-52分离后，可得3个峰(图1)，透析(截留分子量8000～14000)、浓缩、冻干各峰组分，得到BSP-1、BSP-2、BSP-3。BSP精制对2个主要组分BSP-1、BSP-3用琼脂糖凝胶柱SepharoseCL-6B进一步的分离纯化，用纯化水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。洗脱曲线(图2)表明，莼菜精制多糖BSP-1、BSP-3组分均一，分别浓缩、冻干。分子量测定色谱条件:色谱柱TSKgelG5000PWxl(10)、G4000PWxl(10)、G3000PWxl(7)(7.8mm×300mm)串联;保护柱TSKPWxlGuardcolumn;Agilent1260示差折光检测器;流动相为纯化水;体积流量0.4mL/min;进样量30μL;柱温30℃;检测器温度35℃;环境温度25℃。称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配制成2mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入GPC软件，建立分子量分布标准曲线，得到分子量对数logMW与洗脱体积VR的线性回归方程logMW=10.513－0.2377VＲ(r=0.9962)，将莼菜多糖各组分导入GPC软件，调用标准曲线，得出莼菜多糖各组分的Mw、Mn和D等，结果见表1，莼菜多糖的分子量分布为(1.0507～1.5208)×106Da，分子量较大。图3显示，高效凝胶渗透色谱图出峰时间单一，可知莼菜多糖各组分均一性良好。感谢在座各位聆听