核酸的分离提取及定量VIP免费

动物组织中核酸的提取实验目的及意义能够说出组织DNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备DNA能够说出组织RNA分离提纯的原理及方法并能够抽提制备RNA。前言前言核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。分离纯化核酸的原则1.应保证核酸一级结构的完整性一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求①减少化学因素化学因素对核酸的降解：a.a.温度温度不要过高；b.控制pHpH值值范围(pH值5-9);c.保持一定离子强度离子强度;;②减少物理因素物理因素对核酸的降解：避免机械剪切力机械剪切力破坏核酸结构分离纯化核酸的原则③防止核酸的生物降解生物降解：a.细胞内或外来的各种核酸酶核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。b.进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。c.所用器械和一些试剂需高温灭菌高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸核酸酶抑制剂。酶抑制剂。分离纯化核酸的原则2.排除蛋白质、脂类、糖类蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染3.无其他核酸分子其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子时应去除RNA分子）。核酸的性质1.DNA、RNA的理化性质特点：①核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸具有两性性质，是两性电解质两性电解质。②由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸通常表现为酸性核酸通常表现为酸性，等电点比较低。如DNA的等电点为pI4-4.5，RNA的等电点为pI2-2.5。③DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。④DNA和RNA都是极性化合物，因此他们一般都微溶于一般都微溶于水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂水，而不溶于乙醇，乙醚，氯仿等有机溶剂。核酸的性质2.核酸的存在方式：DNA和RNA在细胞中通常以与蛋白质结合的状态存在。他们与蛋白质结合形成的复合物分别称为DNP（脱氧核糖核蛋白）和RNP（核糖核蛋白）。核酸纯化原理DNA分离纯化原理：脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白（DNPDNP）在）在0.14mol/LNaCl0.14mol/LNaCl中溶中溶解度很低，而核糖核蛋白（解度很低，而核糖核蛋白（RNPRNP）却较易溶解，因此用上述浓）却较易溶解，因此用上述浓度的度的NaClNaCl洗涤组织匀浆，可得到洗涤组织匀浆，可得到DNPDNP，再用氯仿，再用氯仿--异戊醇除异戊醇除蛋白即可得到蛋白即可得到DNADNA。。RNA分离纯化原理：组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)存在下，存在下，RNRNAA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNARNA则溶解在水相中，则溶解在水相中，用乙醇使用乙醇使RNARNA从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。DNA分离纯化实验步骤剪碎组织放入匀浆器加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液7mL弃上清。沉淀中加入0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA液6mL混匀。匀浆，离心5000r/min，5min沉淀中加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA,转入匀浆器匀浆，在搅拌下缓缓滴入250g/LSDS0.4mL匀浆，使沉淀悬浮均匀再加入2mol/LNaCl4mL（此时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆，使之均匀）加氯仿-异丙醇5mL，剧烈振摇10min。混合物离心上层水液，下层氯仿，交界面为变性蛋白。收集上层水液边摇变加入等体积95%乙醇，即可见有长纤维状DNA析出5000r/min离心5min3000r/min离心10minRNA分离纯化实验步骤加入3mL0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液,250g/LSDS0.5mL，匀浆移入三角烧瓶中，65℃水浴中继续振摇5-8min，取出流水冷却5000r/min离心10-15min上层为稍浑浊含有RNA的水相，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残渣含有DNA。收集上层水液于量筒中，测水液的体积，加入1/10体积的2mol/L醋酸钠溶液，混匀。再加2.倍体积预冷的无水乙醇，混匀，冷处放置至絮状沉淀充分形成（絮状沉淀即为RNA）再加入等体积80%酚（约4mL），匀浆核酸分离纯化中各试剂的作用①DNP在2mol/LNaCl中易溶解DN...