流式检测常见问题课件

流式细胞基本知识Q&A 1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W 是只检测荧光的脉冲宽度，FL2-H 是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。2、流式同型对照怎样选择？同型对照（ Isotype Control ）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用 an normal serum （与一抗相同的正常血清）（ must be the same species as primary antibody）。 This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子： 比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b ，clone OX-42 purified IgG ，那么它的isotype 是 mouse IgG2a ， 所以可以用purified （纯化的）mouse IgG2a 来做 OX-42 的同型对照（ Isotype Control ）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。同型对照：是指与MoAb 相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC 、IgG2 ａ、 PE 等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC 受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb 所标记的荧光色素、浓度、F：P 比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb 不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：（1） 钙荧光探针负载；（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F 值。（3）加入 10%Triton X 100 ，（破膜用）；加入1 mmol/L 氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育 1~10min ，测定荧光即Fmax 值。（4）加入 EGTA ， 20μ l（钙螯合剂），孵育1~10min ，激发波长488nm 测定荧光，即Fmin 值。这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。因为正常血浆中Ca 2＋浓度是 1mM ，细...