人胰岛素的制备 一、 获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA 互补DNA，再以cDNA 第一链为模板，在反转录酶或DNA 聚合酶I 的作用在，最终合成编码它的双链DNA 序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA 的提取 : 取胰岛B 细胞，用PBS 洗后，加入TRIZOL 试将细胞破裂，后用DEPC 处理，多次离心后，取RNA 白色沉淀，测OD 值，电泳。 2 ，从总RNA 中分离mRNA： 取上述提取的总RNA 若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解 RNA 的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让 Oligotex与 mRNA 结合）。 将Oligotex/mRNA 复合物的沉淀加到EP 管 SPIN 柱上高速离心，加Buffer 将其他 RNA 洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化 mRNA。 （二）mRNA 转录合成cDNA 第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNA 和适当引物于 EP 管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10 分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA 酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置 2 分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。 （三）PCR 法扩增，特异合成目的cDNA 链 通过胰岛素的特异引物，用PCR 法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链 。 PCR 法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35 次 最后延伸 前端引物： 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ 后端引物： 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 二、 组建重组质粒 采用pQE--30 质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体 DNA 和外源 DNA 片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组 DNA 分子，从而实现 DNA 的定向连接。 ２.重组过程 pQE--30 用Hind Ⅲ和 BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源 DNA 片段同样也用Hind Ⅲ和 BamHⅠ酶切并回...
