Westernblot一、实验目的western 技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。二、原理与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 WesternBlot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。三、操作步骤（一）样品处理1 培养的细胞：⑴ 去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落）。⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min。⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在 EP 管后超声（100〜200w）3s,2 次。⑷12000g 离心，4°C,2min。⑸ 取少量上清进行定量。⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loadingbuffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于 lxloadingbuffer）可以低温储存，-70C—个月，-20C—周，4C1~2 天，每次上样前 98C，3min。或收取细胞于 EP 管中加入适量的 IxSDS，吹匀，100 度 5min,重复一次。1200rpm,10min.取上清定量。3．组织：⑴ 匀浆对于心肝脾肾等组织可每 50〜100mg 加 1ml 裂解液，肺 100〜200mg 加 1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵12000g 离心，4C，2min。⑶ 取少量上清进行定量。⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loadingbuffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于 1xloadingbuffer）可以低温储存，-70C—个月，-20C—周，4C1~2 天，每次上样前 98C，3min。由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加 Na3VO40.1mM 及 NaF25mM）。1xloadingbuffer 配方：10%甘油，50mMTris・Cl（pH6.8），2%卩-巯基乙醇，0.2〜0.5%o溴酚蓝，2%或 5%的 SDS。Buffer 可配成 2x~5x，注意 SDS 终浓度勿超过 10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用 5%的 SDS，肝肾等组织 2%即可。）二）配胶1. 注意一定要将玻璃板洗净，最后用 ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶均可事...
