下载后可任意编辑原核表达操作步骤及注意事项12024 年 4 月 19 日下载后可任意编辑原核表示操作步骤及注意事项时间： -03-03 14:05:01 来源： 作者： 点击： 1046 次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表示大量蛋白质的方法一般称为原核表示。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表示重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培育的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。可是，在大肠杆菌中表示的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表示蛋白的生物学活性及构象。表示载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表示载体一般为质粒，典型的表示载体应具有以下几种元件：22024 年 4 月 19 日下载后可任意编辑（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表示一般程序如下：获得目的基因－准备表示载体－将目的基因插入表示载体中（测序验证）－转化表示宿主菌－诱导靶蛋白的表示－表示蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备32024 年 4 月 19 日下载后可任意编辑1、LB 培育基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于 100ml ddH2O 中，0.22μm 滤膜抽滤，-20℃保存。二、操作步骤（一）获得目的基因1、经过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。2、经过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。（二）构建重组表示载体42024 年 4 月 19 日下载后可任意编辑1、载体酶切：将表示质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。2、PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。（三）获得含重组表示质粒的表示菌种1、将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入...
