下载后可任意编辑一 谷胱甘肽还原酶( GR) 活性一、 材料、 仪器设备及试剂 ( 一) 材料 棉花 ( 二) 仪器设备 研钵, 高速冷冻离心机, 紫外分光光度计, 试管数支。 ( 三) 试剂( 1) 0.1M( pH7.5) 磷酸缓冲液 (PBS,含 1%PVP); 0.2mM EDTA; 1.5mM MgCl2; 0.025mM NADPH; 0.25mM 氧化型谷胱甘肽( GSSG) 二、 实验步骤 1、 酶液提取取 1g 棉花叶片于预冷的研钵中, 加 1 ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆, 加缓冲液使终体积为 5 ml。取 5 ml 于 1 r/min 下离心 20min, 上清液即为 GR 粗提液。2、 显色反应取透明度好、 质地相同的 15mm×150mm 试管 4 支, 2 支为测定管, 另 2 支为对比管。按下表加入各种溶液: ( 测定时按表格中各溶液的量加倍, 以便于重复测定两次。) 显色反应试剂配制表试剂名称用量( ml) 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (PBS)1.5mmol/L MgCl20.2mmol/L EDTA 0.025mmol/L NADPH0.25mM 氧化型谷胱甘肽( GSSG) 酶液蒸馏水总体积0.20.10.10.20.20.223对比 2 支管不加酶液混匀后比色, 3min 内每 30s 记录一次数据三、 结果计算GR 总活性＝( A0-As) ×VT/(A0×0.5×FW×V1)式中: GR 总活性以酶单位每克鲜重表示; 下载后可任意编辑A0——为照光对比管的吸光度; As——为样品管的吸光度; VT——为样品液总体积 ml;( 5 ml) V1——为测定时样品用量 ml; (0.2 ml)FW——为样品鲜重 g;(1g)二 H2O2 含量测定二、 仪器与用具分光光度计、 离心机、 研钵、 5ml1 支, 容量瓶 10ml 7 个、 移液管 0.2ml, 离心管5ml 8 支三、 试剂及其配制( 1) 100uM H2O2 丙酮试剂: 取 30%分析纯 H2O2 57ul,溶于 100ml 丙酮中, 此液稀释 100 倍。( 2) 2M 硫酸( 3) 丙酮( 4) 浓氨水( 5) 5%( W/V) 硫酸钛( 6) 0.3% H2O2 : 吸取 0.5ml 30% H2O2 用 50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液( PBS) 定容至50ml 。四、 方法1 标准曲线制作 取 10ml 离心管 7 支, 顺序编号, 按表加入试剂试剂离心管号1234567H2O200.10.20.40.60.81.04°C 预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心 10min,弃去上清液, 留沉淀2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0下载后可任意编辑待沉淀完全溶解后, 将其小心转入 10ml 容量瓶, 蒸馏水冲洗离心管, 将洗涤液合并后定容...
