1 / 15 细胞培养第一节细胞培养基本技术一、免疫细胞分离技术 1、淋巴细胞的分离取肝素抗凝血1m1加 Hanks 液 1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内( 注意勿与分离液混合，然后2000r ／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞( 图 2—1) 。用毛细管伸至单个核细胞层中( 位于细胞分离液与血浆的界面上 ) ，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次，每次2000r ／min 离心 10min，最后用RPMI l640培养液将细胞配成2× 106／m1的细胞悬液备用。 2、T 细胞及 B细胞的分离将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T 细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱 ( 塑料管 ) 的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。 3、CD4细胞及 CD8细胞的分离（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC— 10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的 CD4细胞。（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG( 浓度为 10μ g／m1)包被一平皿表面，然后放置 4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T 细胞 (细胞浓度为1× l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置 2 小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。 CD4细胞亦可用此法分离。 4、单核巨噬细胞的分离单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液( 如实物动物的腹腔液) 加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C0 2 温箱内温育1 小时，然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。二、肿瘤细胞株的传代培养传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感...
