。。1 页博客相册个人档案好友细胞消化胰酶的配制对一般细胞 0.25% 胰酶 ( 胰蛋白酶, Trypsin) 配方: 100ml PBS,0.25g胰酶步骤: 1 先配 100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2 ·12H2O /2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于 1000ml 蒸馏水 ) 2 称胰酶 0.25g 3 加入 PBS中,低速搅拌〈 4h 冰浴中 , 或者 4℃过夜低速搅拌 0.5h 冰浴中4 调 PH7.4 5 仍在冰浴中6 过滤,分装, -20 ℃保存, 4℃短期内用完tip:低速很重要,机械搅拌对酶是一种冲击,如果起沫,酶就变性了。低温,防止酶失活对难消化的细胞:在上述配方中,加入0.02g 的 EDTA(0.02%) tip:因为 EDTA可以络合 Ca2 ,增加消化效力问:请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用!多谢!答: 1、胰酶是 0.25%, 这是质量体积比,就是说0.25g 胰酶溶于 100ml PBS, 注意,尽量不要用水来溶,因为要保持渗透压。2、EDTA的工作液溶度是0.02%-0.1%,根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的, 容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响,因此使用时要甚重。如果影响贴壁,但消化时必须要用,那么在用完全培养基终止消化后,可离心弃上清,再加完全培养基培养,可去除EDTA。 如果对贴壁没影响,那么可不离心。3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。4、注意,血清可终止胰酶的作用,但不能终止EDTA的作用,对有些细胞来说,终止消化后的离心是必要的。5、胰酶和 EDTA在 pH 为 8 左右的时候最易溶解,在配制时可先滴几滴NaOH将 pH调至 8,注意, 胰酶可使溶液变酸,所以要边溶边测pH,随时调整。注意,不可加过量NaOH,否则过碱,细胞会受不了。6、胰酶 EDTA相对比较难溶,可用磁力搅拌器,或放入4 度冰箱过夜,待溶解后过滤除菌。7、可配 2-3 乘的胰酶,这样比较节约时间和滤器,用的时候对上灭菌PBS即可。8、储存液放在- 20 度冰箱冻存,使用液放在4 度,用的时候不要放在27 度水浴锅温浴,因为这样会让胰酶很快失效,使用前放在室温下一会,因为加的量很少,所以一般不会冻坏细胞。。。2 9、消化时,向培养瓶中加入适量胰酶,个人经验,一般10cm 培养皿加入0.5ml 足已,加入后,立刻摇晃培养皿,使胰酶铺满,一旦铺满,立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶,再放入37 度培养箱消化。10、注意,过量的胰酶对细胞是有害的,而EDTA过多也会影响贴壁,所以没必要把细胞泡在胰酶...