胰酶配制及注意事项

。。1 页博客相册个人档案好友细胞消化胰酶的配制对一般细胞 0.25% 胰酶 ( 胰蛋白酶， Trypsin) 配方： 100ml PBS,0.25g胰酶步骤： 1 先配 100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2 ·12H2O /2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于 1000ml 蒸馏水 ) 2 称胰酶 0.25g 3 加入 PBS中，低速搅拌〈 4h 冰浴中 , 或者 4℃过夜低速搅拌 0.5h 冰浴中4 调 PH7.4 5 仍在冰浴中6 过滤，分装， -20 ℃保存， 4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g 的 EDTA(0.02%) tip:因为 EDTA可以络合 Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。急用！多谢！答： 1、胰酶是 0.25%, 这是质量体积比，就是说0.25g 胰酶溶于 100ml PBS, 注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。EDTA并不是必须的， 容易消化的细胞可不加。EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。 如果对贴壁没影响，那么可不离心。3、EDTA的浓度也是质量体积比。和胰酶一起溶于PBS。4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。5、胰酶和 EDTA在 pH 为 8 左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将 pH调至 8，注意， 胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。6、胰酶 EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4 度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。7、可配 2－3 乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。8、储存液放在－ 20 度冰箱冻存，使用液放在4 度，用的时候不要放在27 度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏细胞。。。2 9、消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm 培养皿加入0.5ml 足已，加入后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入37 度培养箱消化。10、注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞泡在胰酶...