11 月 13 日 引物合成的详解 4.需要什么级别的引物？ 答：引物常用的纯化方式C18 脱盐，OPC 纯化，PAGE 纯化，HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR 扩增 <45 base OPC 一般PCR 扩增 >45 base PAGE 诊断PCR 扩增 < 40base OPC, PAGE DNA 测序 20base 左右 OPC 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE， HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 8.如何计算引物的浓度？ 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD 数 *（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除 ) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml. 9.如何计算引物的Tm 值？ 答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为 25mer 以下的引物，Tm 计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm 计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 11.如何溶解引物？ 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH 值比较低（pH4-5） ,引物在这种条件下不稳定。 12.如何保存引物？ 答： 引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 13.合成的引物5’端是否有磷酸化 答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。 14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应...
