试验40植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定

实验 40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H 2O2 发生累积。 H 2O2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H 2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中 H2O2 含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2 与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在 415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2 浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml× 2 支， 5ml×1 支；容量瓶10ml×7 个，离心管5ml×8 支；离心机；分光光度计。【试剂】100μ mol/L H2O2 丙酮试剂：取30%分析纯 H2O2 57μ l，溶于 100ml，再稀释 100 倍；2mol/L 硫酸； 5%（W/V ）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】1.制作标准曲线：取10ml 离心管 7 支，顺序编号，并按表40-1 加入试剂。表 40-1 测定 H2O2 浓度标准曲线配置表试剂（ ml）离心管号1 2 3 4 5 6 7 100μ mol/L H 2O20 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4℃下预冷丙酮1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5%硫酸钛0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 3000r/min 离心 10min ，弃去上清夜，留沉淀2mol 硫酸5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml 容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度， 415nm 波长下比色。2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视 H 2O2 含量多少而定） ，按材料与提取剂 1∶ 1 的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心 10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2) 用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1 加入 5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min 离心 10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5 次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol 硫酸 5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：植物组织中H2O2 含量 (μ mol/g Fw)=CVtFWV 1式中C—标准曲线上查得样品中H2O2 ...