质粒DNA的提取及检测试验报告

四川大学实验报告1 / 9题目：质粒 DNA的提取及检测一． 实验目的 : 1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。二． 实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。2. 载体(Vector) ：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、 M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。3. 分离质粒 DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。4. 碱裂解法（1）溶液Ⅰ： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ： 0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前 1：1 配制作用：细胞在 NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性四川大学实验报告2 / 9（3）溶液 Ⅲ ：5mol/L 醋酸钾 60ml，冰醋酸 11.5ml ，双蒸水 28.5ml 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质 -SDS复合物等发生沉淀。5. 电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp 至近 50kb 的 DNA分子。 DNA的迁移率（ U）的对数与凝胶浓度（ T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。6. 提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环 DNA 、闭环超螺旋 DNA 。当提取的质粒 DNA电泳时 , 同一质粒 DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。三． 实验材料及设备1.实验材料：（1）含质粒pUC18大肠杆菌， 1.5ml 塑料离心管， EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；（2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：2.实验仪器：四川大学实验报告3 ...