一， 引物设计 :1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。2，在 NCBI 上再次确认目的片段的碱基序列。1， 使用 word 排除目的片段里含有的酶切位点， 最后确定所使用的酶。2， 设计引物： primer-up：-- -------Primer-down：----- ------ 3， 核对 ---- 送公司合成。4， 对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10 分钟、 at 4 ℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起， at 4 ℃保存。二， PCR（P 出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P 出目的片段：1，揺菌过夜：2ul 韩家淮实验室的菌液，Xul 相应的抗生素3ml LB 94℃ 5min2,pcr: 菌液 1ul 94℃ 30sec2x PFU mix 25ul 58℃ 30secPrimer 1ul 72℃ X min2d H2O 23ul 72℃ 5min （X 是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm 值来计算，一般低于Tm 值 2℃）3，跑胶、回收 : （1），配胶：称 0.6g 的琼脂糖加入 60ml 的 1X TAE 加入 0.6ul 的 EB(待温度降到 50-60℃左右时 ) 25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶： 130-150V、25-30 分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根 {TIANGEN}公司的 DNA纯化回收试剂盒） : 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在 55-65 ℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在 37℃温保护碱基 4 个上游酶切位点首位 20 个碱基保护碱基 4 个下游酶切位点末尾20 个碱基的反向互补碱基15ml 离心管Pcr(50ul)反应体系Pcr温 度 体系33cycles 1% 的琼脂糖胶：大块煮沸 3 次箱中 2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul 的体系：回收产物 2ul 、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul 。三， 酶切、链接：1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4 小时）insert ：上述胶回收产物35ul 10 x H buffer （1.5x） 7ul 50ul 的体系 dd H2O 6ul 酶 1 1ul 酶 2 1ul2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者 4 小时）Vector （1ug/ul）：2 ul 10 x buffer （1.5x） 3ul20ul 的体系dd H2O 13ul 酶 1 1ul 酶 2 1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3， 酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一...
