细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜)进行定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法:琼脂糖凝胶电泳,形态学观察(透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法),Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等。不能将二者区分开的方法:原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。三、样品来源不同选择组织:主要用形态学方法(HE 染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。四、细胞凋亡检测1、早期检测:1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测2)细胞内氧化还原状态改变的检测3)细胞色素 C 的定位检测4)线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测:细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核 DNA,产生大量长度在 180-200bp 的 DNA 片段。对于晚期检测通常有以下方法:1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记)2)LM-PCRLadder(连接介导的 PCR 检测)3)TelemeraseDetection(端粒酶检测)3、生化检测:1)典型的生化特征:DNA 片段化2)检测方法主要有:琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记(TUNEL)等3)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记)4)通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP(多为 dUTP)间接或直接接到 DNA片段的 3'-OH 端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。4、LM-PCRLadder(连接介导的 PCR 检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少(如活体组织切片)时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA 的变化。通过 LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少,还可在分离提纯 DNA 后,用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使 DNA 标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中 DNAladder 的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核 DNA 断裂这一特征,但细胞受到其它损伤(如机械损伤,紫外线等)也...