. . 重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。学习利用 T4DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来， 构建体外 DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。掌握利用 Cacl2 感受态细胞的方法。学习掌握热击法转化E.coli 的原理和方法。掌握α 互补筛选法和PCR 检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA 片段的大小。学习和掌握PCR 反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。实验原理：外源 DNA 与载体分子的连接即为DNA 重组技术，这样重新组合的DNA 分子叫做重组子。重组的 DNA 分子式在 DNA 连接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA 分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α 互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR 检验的方法进行重组子的鉴定。重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点， 否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法. . 和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中， 限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10% ，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% ...
