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食品酶学试验-菠萝蛋白酶重点讲义资料

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1 食品酶学综合性实验实验 1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定【目的和要求】1. 了解酶分离纯化的一般程序;2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法;3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。【实验原理】1.建立有效的酶纯化程序应考虑的原则(1)利用酶在分离纯化上最有利的特性;(2)尽早使用一种选择性好的方法;(3)选择交换能力高的层析技术作为第一步层析;(4)不要连续使用相同的纯化方法;(5)将各层析步骤连接起来,使前一步得到的样品适用于下一步层析;(6)在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法;(7)要使每步过程的分辨能力呈递增趋势;(8)每步纯化过程后,通过量体积, 酶活力和蛋白质浓度测定,监测纯化的进程。2.菠萝蛋白酶简介菠萝蛋白酶( Bromelain ,EC 3.4.22.3)简称菠萝酶,是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂,能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。1891年Mercaro 于菠萝的汁中首先发现。菠萝蛋白酶属于糖蛋白,是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物,因含有一个不稳定的游离巯基,所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW ,等电点9.55,最适 pH在7.1左右, 在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的2 温度的最稳定范围是55℃~65℃。金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大,维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂,,EDTA 能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶,有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。3.菠萝蛋白酶的粗分离(1)盐析分离盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中,蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高,这种现象称为盐溶。但当盐浓度增加到一定量时,其溶解度又逐渐下降,直到某一浓度时便从溶液中沉淀出来,这种现象即为盐析。利用盐析作用可使不同蛋白质从溶液中析出从而实现分离。这是因为蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解,故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 盐析不同的蛋白质所需中...

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