蛋白纯化技术徐剑光2016.7.9Contents层析概述四大层析纯化策略层析概述•“色层分析”•俄国植物学家M.Tswett于1906年首先提出•原理：利用各组分在流动相和固定相之间物理性质（吸附、分配等）差异，对多组分混合物进行分离的方法。•常见：吸附层析，分配层析层析概述—参数与术语•分离体积•分辨率•选择性•柱效•对称性•线性流速•载量层析概述—参数与术语VR=V0+kVi分离体积层析概述—参数与术语分辨率：分辨峰的能力层析概述—参数与术语层析概述—参数与术语层析概述—参数与术语层析概述—参数与术语层析概述—塔板理论&速率理论塔板理论：将色谱柱假想为一个精馏塔，色谱柱中的固定相形象化为一系列连续的、相等体积的塔板。每一块塔板的高度称理论塔板高度H（板高）。层析概述—塔板理论&速率理论速率理论：吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，定量地解释了影响塔板高度的各种因素。其中：A、B、C为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数和传质阻力系数。上式即为范第姆特方程式的简化式。层析概述—塔板理论&速率理论A=2λdp气流碰到填充物颗粒时，不断改变方向，使试样组分在气相中形成紊乱的类似涡流的流动。层析概述—塔板理论&速率理论色谱柱的轴向分子扩散（轴向扩散）浓度梯度引起的分子扩散行为（浓差扩散），导致峰展宽。B=2Dg：弯曲因子，反映柱填充物对分子扩散的阻碍程度Dg：试样组分分子在气/液相中的扩散系数(cm2·s-1)层析概述—塔板理论&速率理论传质阻力——传质过程（平衡）中所受的阻碍气液界面气相液相载气四大层析•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水层析•亲和层析四大层析—凝胶过滤层析凝胶过滤层析：根据分子的大小来分离生物分子的一种简单可靠的层析技术。四大层析—凝胶过滤层析怎么做？•知道分子量大小和差异（相差一倍以上）•选择合适的填料•选择合适的层析柱四大层析—凝胶过滤层析主要应用：•组分离脱盐/缓冲液置换•精细分离聚集体去除，分离不同分子大小的蛋白•检测用途计算分子量纯度检测四大层析—凝胶过滤层析实验步骤：平衡-上样-洗脱-再生四大层析—离子交换层析离子交换层析：根据不同生物分子所带电荷性的差异进行分离的一种方法。正负电荷相互吸引四大层析—离子交换层析原理——蛋白质荷电滴定曲线四大层析—离子交换层析四大层析—离子交换层析怎么做？•选择离子交换填料阳离子/阴离子，强/弱•选择缓冲液PH，缓冲体系，添加剂•选择洗脱方式线性洗脱or步级洗脱四大层析—疏水作用层析疏水作用层析：依据生物分子之间的疏水性差别进行分离的一种方法。四大层析—疏水作用层析疏水作用层析原理：四大层析—疏水作用层析疏水作用填料：四大层析—疏水作用层析怎么做？PH，温度，盐种类四大层析—亲和层析亲和层析：通过生物分子间的特异性相互作用来分离物质的一种方法。四大层析—亲和层析亲和层析原理：四大层析—亲和层析亲和层析步骤：平衡上样洗脱重生纯化策略•建立检测方法•确立目标（纯度和产量）•目标蛋白的性质•使用不同原理的纯化方法•减少步骤•尽量减少每步之间样品条件的改变•选用高选择性的方法•工艺方法尽量简单•….开发纯化方法的注意点：纯化策略三步法：捕获中度纯化精纯纯化策略捕获：速度，载量目的：浓缩，稳定蛋白纯化策略中度纯化：分辨率，载量目标：去除主要杂质纯化策略精纯：分辨率，收率目的：除去痕量杂质纯化策略适用于三步纯化策略的层析技术：纯化策略衔接层析技术时的注意事项：纯化策略设计合理的纯化线路：ACcaptureIntermediatepurificationpolishingACACIEXHICHICIEXGFGFGFIEX
