第三章基因文库的构建VIP免费

第三章基因文库的构建主要内容第一节DNA基因文库第二节亚克隆第三节克隆DNA序列的体外诱变第四节基因编码序列的丙氨酸扫描诱变2DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化机械切割双链cDNA的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定核酸杂交免疫学分析酶切鉴定大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案3EcoR1Sal1EcoR1Sal1PolylinkerBamH1PolylinkerBamH1ABRed+gam+Sal1Sal1λEMBL3AABBamH1BamH1Red+gam+EcoR1EcoR1RightarmpolylinkeroligonucleotideLeftarmpolylinkeroligonucleotideDigestwithBamH1andEcoR1ABBamH1BamH1EcoR1RightarmLeftarmIsopropanolprecipitationpolylinkeroligonucleotidenotprecipitatedTargethighmolecularweightgenomicDNASau3A1Sau3A1Sau3A1Sau3A1OHHOOHHOHOHOHOOHOHOHSau3A1Sau3A1Sau3A1Sau3A1Sau3A1Sau3A1SizefractionationnotneccessaryPartialSau3A1digestPhosphataseABBamH1BamH1RightarmLeftarmSal1Sal1RecombinantphageDNAconcatemers+PackaginginvitroPlateonP2lysogensup+Recombinant(Spi-)phageplaques用λ载体EMBL3A构建基因组文库4第一节DNA基因文库用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。cDNA文库：某个特定物种或器官的所有mRNA的组合。建立DNA文库的目的：从复杂的基因组中分离基因。5二、DNA文库的构建（一）、基因组DNA库1、用λ克隆载体构建基因组文库Question1：构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组？考虑两个因素：载体的装载能力目标基因组的大小目标基因组的大小载体装载的平均片段＝重组子的个数6（一）、基因组DNA库Question2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？考虑两个实际问题：选择的载体装载量所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割二、DNA文库的构建7人类基因组2.8X106Kbλ置换载体的平均置换片段20Kb重组子的最小数目n＝1.4X105考虑取样，酶切等原因，某些基因可能有多个重组子，而某些基因完全不包含。通过概率的统计，人类基因组中某个特异的片段有95％概率包含所需要的重组子为n＝4.2X105二、DNA文库的构建82、高容量载体构建基因组克隆优点：A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）。B、目标基因相对比较完整。二、DNA文库的构建9第二节亚克隆概念：对已经获得的目的DNA片段进程重新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分析，或进行重组改造等。过程：1）目的DNA片段和载体制备；2）目的DNA片段与载体相连；3）连接产物的转化；4)重组子的筛选10第二节亚克隆对大片段的插入片段进行亚克隆的过程1）首先确定该大片的限制酶酶切图谱2）根据已知的酶谱进行定向克隆3）或鸟枪法进行随机克隆11通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点。以λDNA为例1213按照诱变产生的不同效果分类：随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法）第三节：克隆DNA序列的体外诱变14第三节：克隆DNA序列的体外诱变一、缺失诱变1、通过从末端或中间删除一些核苷酸序列•末端删除部分序列15末端标记外切酶III处理SI核酸酶处理Klenow酶，连接酶处理16一、缺失诱变2、通过酶切图谱完成中间缺失17二、盒式突变1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。2、人工合成的突变序列的特征由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端,由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。第三节：克隆DNA序列的体外诱变18盒式突变举例1···AAGCTT···target···GAATTC······TTCGAA···target···CTTAAG···HindIIIEcoRI···AAATTC······TTTCGAG···AGCTTTA...