第五章单克隆抗体第一节、免疫学基础知识•抗原：可刺激机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。抗原的两大特点：免疫原性、反应原性•抗原决定簇：又称抗原表位，指位于抗原表面或内部的、具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与其相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的结构。•佐剂：与抗原同时或预先注射，可非特异性地增加或改变机体对抗原免疫应答的一类物质称为佐剂。•种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌）是目前动物实验中最常用佐剂。•抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。BB淋巴细胞本身是一种淋巴细胞本身是一种终末分化细胞终末分化细胞，通常不再进行细，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞短命细胞脾脏与脾脏与BB淋巴细胞淋巴细胞(Blymphocytes)(Blymphocytes)一般来讲，脾脏有三大功能：1.它是“血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。•B淋巴细胞发育过程：祖B淋巴细胞前B淋巴细胞成熟B淋巴细胞抗原刺激、递呈细胞和Th细胞作用活化B淋巴细胞分化为浆细胞•单克隆抗体：指由单一B细胞增殖分化形成的子代细胞(浆细胞)产生的只识别单一抗原决定簇的抗体。•多克隆抗体：由于一个抗原上往往有多个抗原决定族，会引起多种B细胞增殖、分化形成多种浆细胞，后者分泌的多种抗体混合在一起存在于机体的血清中，又称抗血清。•多抗：制备简单、免疫效果强大，但特异性差。•单抗：均一性好、特异性强。脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞))骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体短命短命分泌抗体分泌抗体长命长命KöhlerKöhler和和MilsteinMilstein19841984年年NobelNobel医学奖医学奖杂交瘤技术制备单杂交瘤技术制备单抗的基本原理抗的基本原理杂交瘤技术制备单杂交瘤技术制备单抗的基本原理抗的基本原理第二节、单抗制备的技术流程骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myelomacells)(myelomacells)的选择原则的选择原则①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时；②缺乏HGPRT酶和TK酶；③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；（一）、亲本细胞的选择（一）、亲本细胞的选择（一）、亲本细胞的选择（一）、亲本细胞的选择脾细胞的选择脾细胞的选择由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Balb/c小鼠，因此应尽量选择同源的Balb/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。（二）、杂交瘤技术的操作流程（二）、杂交瘤技术的操作流程（二）、杂交瘤技术的操作流程（二）、杂交瘤技术的操作流程1.1.动物免疫：动物免疫：1.1.动物免疫：动物免疫：目的：目的：在细胞融合后获在细胞融合后获得尽可能多的分得尽可能多的分泌针对于该目标泌针对于该目标抗原的特异性抗抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞..特定特定目标抗原目标抗原动物动物免疫免疫脾脏中脾脏中BB淋巴细胞淋巴细胞BB淋巴细胞淋巴细胞大量增殖大量增殖刺激刺激能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗原的原的特异性抗体特异性抗体免疫方案a.颗粒性抗原（以细胞性抗原为例）:初次免疫1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5mlip↓3周后加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射)↓取脾融合b.可溶性抗原（免疫原性弱，一般要加佐剂）初次免疫Ag1-50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融...
