24/10/241第十一章、酶活力测定第十一章、酶活力测定24/10/242第一节、第一节、α-α-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定1、作用2、分类3、测定方法24/10/243一、分光光度法一、分光光度法1.原理α-淀粉酶广泛存在于植物、哺乳类动物和微生物中。能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖甘键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖,而使淀粉对碘呈篮紫色的特异性反应迅速逐渐变红棕色直至消失,其颜色消失的速度与酶活力有关,故可通过测定反应后吸光度计算其酶活力.24/10/2442.试剂原碘液:称取碘11g、碘化钾22g用少量水使碘完全溶解,然后定容至500mL,贮于棕色瓶中.稀碘液:吸取2mL,加碘化钾20g,用水溶解并定容至500mL,贮于棕色瓶中。20g/L可容性淀粉溶液。此溶液需要当天配制。pH6.0、0.02mol/LNa2HPO4-柠檬酸缓冲液。24/10/2453.测定步骤待测酶液的制备:称取酶粉1.000g(或吸取液体酶1.00ml),先用少量的pH6.0缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上清液小心倾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量缓冲液,如此反复捣研3-4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(将酶液稀释至被测试液吸光度在0.12-0.36范围内),摇匀。同过四层纱布过滤,滤液为待测酶液。24/10/246酶活力测定:吸取可溶性淀粉溶液20ml与试管中,加入pH6.0缓冲液5ml,摇匀后于60℃恒温水浴中预热10min。加入稀释好的待测酶液1ml。立刻计时,摇匀,准确反应5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液作空白波长660nm,1cm比色皿,迅速测定吸光度(A)根据吸光度查表,求得测定酶液的浓度(c)。24/10/2474.计算酶活单位定义:在60℃,pH6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉的酶量为1个酶活力单位。α-淀粉酶活力(u/g或u/mL)=c×n式中c----测试酶液的浓度(u/ml);n----样品的稀释倍数。以结果表示至整数。24/10/248二、目视比色法二、目视比色法1.原理α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖,使淀粉与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消失,观察并测定颜色的消失速度可以衡量酶活力的大小。24/10/2492.试剂原碘液:同“分光光度法”。稀碘液:同“分光光度法”。20g/L可溶性淀粉溶液:同“分光光度法”PH6.0、0.02mol/LNa2HPO4—柠檬酸缓冲液标准终点色溶液甲液:准确称取氯化钴40.2439g和重铬酸钾0.4878g,用水溶解并定容至500ml。乙液:准确称取铬黑T40mg,用水溶解并定容至100ml。取甲液40ml与乙液5.0ml混合,即为标准终点色溶液。该溶液在冰箱内保存,使用15d后需重新配制。24/10/24103.测定步骤:待测酶液的制备:同“分光光度法”测定:取2ml标准终点色溶液于白瓷板孔穴内,作为比较颜色的标准,其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取可溶性淀粉溶液和5mLpH6.0缓冲液于试管中。在60℃恒温水浴中预热10min。然后准备加入0.5mL稀释酶液,立即记时。充分摇匀。定时用滴管取出约0.5mL反应液,滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴内,当孔穴内颜色由蓝紫色逐渐变为与标准终点色(红棕色)相同时即为反应终点,记录反应时间t(min)。24/10/24114.计算酶单位定义:在60℃,pH6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉的酶量为一个活力单位。α-淀粉酶活力(u/g或u/mL)=20×0.2×60/t×1/0.5×1/m×n式中20----可熔性淀粉吸取量(mL);0.02----1mL可溶性淀粉溶液中含可溶性淀粉质量(g);t----酶解反应时间(min);0.5----吸取稀释酶液体积(mL);n----酶液稀释倍数;m----称取酶粉的质量(g)。24/10/24125.讨论(1)商品α-淀粉酶粉剂活力为1500~2500u/g,稀释倍数一般为100~200倍。(2)可溶性淀粉的质量对α-淀粉酶活力有一定影响,为统一起见,可溶性淀粉采用浙江菱湖淀粉厂产的酶制剂专用可溶性淀粉。。24/10/2413第二节糖化酶活力测定第二节糖化酶活力测定1.原理糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物中。糖化酶催化淀粉水解,从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖,葡萄糖分子中含有醛基,能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算出酶活力。24/10/24142.试剂(1)pH4.60.1mol/LHAc缓冲液;(2)0.05mol/L...