酶活力测定讲解VIP免费

24/10/241第十一章、酶活力测定第十一章、酶活力测定24/10/242第一节、第一节、α-α-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定1、作用2、分类3、测定方法24/10/243一、分光光度法一、分光光度法１.原理α-淀粉酶广泛存在于植物、哺乳类动物和微生物中。能将淀粉分子链中的α-１,４葡萄糖甘键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特异性反应迅速逐渐变红棕色直至消失，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过测定反应后吸光度计算其酶活力．24/10/244２．试剂原碘液：称取碘11g、碘化钾22g用少量水使碘完全溶解,然后定容至500mL,贮于棕色瓶中.稀碘液：吸取2mL,加碘化钾20g,用水溶解并定容至500mL,贮于棕色瓶中。20g/L可容性淀粉溶液。此溶液需要当天配制。pH6.0、0.02mol/LNa2HPO4-柠檬酸缓冲液。24/10/245３.测定步骤待测酶液的制备：称取酶粉1.000g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的pH6.0缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将酶液稀释至被测试液吸光度在0.12-0.36范围内），摇匀。同过四层纱布过滤，滤液为待测酶液。24/10/246酶活力测定：吸取可溶性淀粉溶液20ml与试管中，加入pH6.0缓冲液5ml，摇匀后于60℃恒温水浴中预热10min。加入稀释好的待测酶液1ml。立刻计时，摇匀，准确反应5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液作空白波长660nm，1cm比色皿，迅速测定吸光度（A）根据吸光度查表，求得测定酶液的浓度（c）。24/10/247４.计算酶活单位定义：在60℃，pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉的酶量为1个酶活力单位。α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=c×n式中c----测试酶液的浓度（u/ml）；n----样品的稀释倍数。以结果表示至整数。24/10/248二、目视比色法二、目视比色法１.原理α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消失，观察并测定颜色的消失速度可以衡量酶活力的大小。24/10/249２.试剂原碘液：同“分光光度法”。稀碘液：同“分光光度法”。20g/L可溶性淀粉溶液：同“分光光度法”PH6.0、0.02mol/LNa2HPO4—柠檬酸缓冲液标准终点色溶液甲液：准确称取氯化钴40.2439g和重铬酸钾0.4878g，用水溶解并定容至500ml。乙液：准确称取铬黑T40mg,用水溶解并定容至100ml。取甲液40ml与乙液5.0ml混合，即为标准终点色溶液。该溶液在冰箱内保存，使用15d后需重新配制。24/10/2410３.测定步骤：待测酶液的制备：同“分光光度法”测定：取2ml标准终点色溶液于白瓷板孔穴内，作为比较颜色的标准，其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取可溶性淀粉溶液和5mLpH6.0缓冲液于试管中。在60℃恒温水浴中预热10min。然后准备加入0.5mL稀释酶液，立即记时。充分摇匀。定时用滴管取出约0.5mL反应液，滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴内，当孔穴内颜色由蓝紫色逐渐变为与标准终点色（红棕色）相同时即为反应终点，记录反应时间t（min）。24/10/2411４.计算酶单位定义：在60℃，pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉的酶量为一个活力单位。α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=20×0.2×60/t×1/0.5×1/m×n式中20----可熔性淀粉吸取量（mL）；0.02----1mL可溶性淀粉溶液中含可溶性淀粉质量（g）；t----酶解反应时间（min）；0.5----吸取稀释酶液体积（mL）；n----酶液稀释倍数；m----称取酶粉的质量（g）。24/10/2412５.讨论（1）商品α-淀粉酶粉剂活力为1500～2500u/g，稀释倍数一般为100～200倍。（2）可溶性淀粉的质量对α-淀粉酶活力有一定影响，为统一起见，可溶性淀粉采用浙江菱湖淀粉厂产的酶制剂专用可溶性淀粉。。24/10/2413第二节糖化酶活力测定第二节糖化酶活力测定１.原理糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物中。糖化酶催化淀粉水解，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。24/10/2414２.试剂（1）pH4.60.1mol/LHAc缓冲液；（2）0.05mol/L...