人类染色体标本制备及核型分析VIP免费

人类染色体标本制备及核型分析实验三1、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备方法；2、掌握胰酶法G显带的技术；3、掌握G显带核型分析的基本过程和技术；4、熟悉快速线条图的绘制；5、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法。一、目的与要求二、基本原理（一）染色体标本制备外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。染色体标本制作技术有下述四大发现：一、美籍华人徐道觉(1952)从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开；二、Tjio(1956)发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期；三、LiJ．G．发现PHA(phytohemagglutin)(植物血球凝集素)可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，呈分裂状态；四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂的细胞，进而开展临床和基础遗传学的研究。这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥了重要作用。（二）染色体显带人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（bandingtechnique）。研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。关于G显带的机理目前有多种说法，较常见的有1、Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。2、有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。总的来说，G显带的机理还未搞清。三、内容与操作一、染色体G显带标本的制备1.采血：采血过程中严格执行无菌操作。2．接种：超净工作台内0.3～0.5ml轻轻水平摇动混匀。３．培养：5%CO2，37±5℃℃恒温箱培养64-65小时；卡介苗注射器(5号针头)向培养瓶中加入20μg/ml秋水仙素（0.01%）一滴，轻轻摇匀，放回温箱继续培养至68小时。4、离心：10分钟（1500转／分），弃上清液，留下沉淀物。5、低渗：6～8m1预温37℃的0.075MKCl溶液，沉淀细胞重重冲散，37℃水浴箱30-35分钟。6、预固定：1ml新配制的固定剂，轻轻冲打，37℃水浴箱中静置5分钟。7、离心：1500转／分离心10分钟，弃上清液。6．第一次固定：固定液6～8m1，沉淀物轻轻冲打均匀，37℃水浴箱中静置固定10分钟。7、第一次离心10分钟(1500转／分)，弃上清液。8、重复第6、7步。9、制片：留固定液0.2ml～0.4ml，轻轻冲打制成细胞悬液。冰冻载波片，滴管口距离载玻片10～15cm，每片2～3滴。10、烤片：75℃烤箱烤3小时。自然冷却。11、胰酶预温：立式染色缸中磷酸缓冲液100ml（1／15MNaH2PO480.8ml，KH2PO419.2ml)，2.5％的胰蛋白酶原液1ml配成0.025％的工作液。37℃的恒温水浴箱内预温。12、显带：不断轻轻摆动，使胰酶作用均匀，处理时间25～90秒钟左右（较陈旧标本时间适当延长，随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长，精确的时间自行摸索）。取出标本片，立即用37℃预温的生理盐水轻轻漂洗两次，去除片子上的胰酶溶液。13、染色：37℃预温的Giemsa工作液染色1－2分钟，自来水冲洗，气干。14、镜检：低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未...