细胞因子的检测与应用CBAVIP免费

a1细胞因子的检测与应用苏州市跃亚生物技术有限公司赵寅岗暨BDCBA技术简介a2流式的基本原理流式检测细胞因子CBA技术的应用a3流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术定义BDAccuriC6a4流式细胞术原理a5MulticolorResearchApplicationswww.bdbiosciences.com/spectraa6样本收集及处理流式细胞术流程免疫荧光染色上机检测数据分析制备单细胞悬液a7流式细胞术检测样本可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等a8流式细胞仪的检测范围细胞结构•细胞大小•细胞颗粒度•细胞表面积•核浆比例•DNA含量与细胞周期•RNA含量•蛋白质含量•……细胞功能•细胞表面/胞浆/核的特异性抗原•细胞活性•细胞内/外的细胞因子•激素结合位点、细胞受体•蛋白磷酸化•pH值•钙离子浓度•细胞膜电位、线粒体膜电位•……a9流式的基本原理流式检测细胞因子CBA技术的应用a10一个细胞的全面研究a11CellVol.132,January25,2008a12什么是CBA?•多重分析•节约样本•灵敏度高CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹心复合物进行检测。a13++AnalyzeofInterestFluorescentDetectorAb-PECaptureBeadCaptureAb一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。CBA原理a14CBA原理+IL-8IL-6100100101101102102103103104104BeadIntensityFL3(670LP)DetectorAbIntensityFL2(585/42BP)a15BDTMCBAKitsa16操作步骤检测物与捕获微球共孵育标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）洗涤流式细胞仪检测CBA分析软件批量数据分析a17HumanTh1/Th2CytokineCBA–标准曲线5000pg/ml2500pg/ml1250pg/ml625pg/ml312pg/ml80pg/ml20pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.26B=5.00C=3.60D=3.89R^2=0.9973Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.29B=4.24C=3.43D=4.33R^2=0.9991Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.34B=4.11C=3.42D=4.45R^2=0.9987Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.31B=3.86C=3.30D=4.45R^2=0.9980Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.31B=3.77C=3.37D=4.77R^2=0.9997Curve-FittingModel:4-ParameterLogisticy=((A-D)/(1+(x/C)^B))+DA=1.33B=4.08C=3.24D=4.42R^2=0.9987TNF-a110100100010000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIIFN-g1101001000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIIL-10110100100010000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIIl-4110100100010000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIIL-5110100100010000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIIl-2110100100010000110100100010000Concentration(pg/ml)FL2MFIa18CBA分析软件HomeScreenToolbarCalibrationentryscreena19•基本原理与CBAkit相似•检测原理不同：FlexSet微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。BDCBAFlexSeta20BDCBAFlexSetABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-AABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-Aa21CBAFlexSet的分析软件－FCAPArraySoftwarea22CBAKit与CBAFlexSetCBAKit...