牙髓间充质干细胞生产

牙髓间充质干细胞生产 I． 目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 II． 范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。 III． 职责： 1. 生产主管负责本制度的执行和监督； 2. 技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 3. 监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。 附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2 生产试剂耗材记录表 IV． 规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 1）10ml移液管 2）培养皿 3）50ml离心管 4）100μm 筛网 5）T75培养瓶 6）15ml离心管 2.试剂 1）生理盐水 2）培养基 3）胶原酶 3. 酶消化法操作流程 3.1 将浸在含 1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液 4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡 30min； 3.2 取出牙齿在含 10ml生理盐水的培养皿中清洗 2-3遍，用止血钳固定牙冠， 持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶； 3.4 置于37℃恒温摇床，180rmp消化 30min ； 3.5 用100μm 滤网过滤； 3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液 4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 附表 3 样本取样单 3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为 107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO2培养箱中进行培养。 4. 组织块法操作流程： 4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液 4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡 30min； 4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗 2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3 ，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底； 4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养； 4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 1）10ml移液管 2）15ml离心管 2.试剂 培养基 3. 操作流程 3.1 镜下观察状态细胞； 3.2 吸取上清液 4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 3.3 吸取上清液于50ml...