DNA文库的构建VIP免费

DNA文库的构建ConstructionofDNAlibrary内容提要：文库的概念；基因组文库构建；RNA研究方法及cDNA文库的构建过程；基因组与cDNA文库的优缺点；文库的筛选技术；一、文库(library)的概念基因组文库是含有某种生物全部基因组DNA的片断所组成的克隆群；cDNA文库是指含有某生物(更常指该生物的某类型细胞、组织)所有mRNA的DNA拷贝的克隆群；一个“文库”可以是一定量的含有文库载体的细菌、酵母菌等等；基因组文库主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、基因在染色体上定位、基因组中基因组织形式以及基因结构、表达调控元件的分析等；cDNA文库用于特定细胞中基因组基因表达情况、基因功能鉴定，以明了基因在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老凋亡以及健康和疾病中的作用。DNA文库技术的步骤DNA文库技术包括四步：获得片断化的DNA分子；将外源片断插入文库载体；借助高效的过程将其导入到宿主细胞；通过合适的手段筛选出感兴趣的重组克隆；基因组和cDNA文库的特征基因组DNA应该有代表性，包含该生物的所有遗传物质：编码的、不编码的；应该是物种特异性的、而与组织部位无关；cDNA文库是由（某个发育阶段、某种条件之下的）某一组织（某一类细胞）的mRNA反转录成cDNA构建而成，因此只包含被表达基因的编码序列（还有mRNA上的3‘、5’的非翻译序列），来源不同的cDNA文库，即使是同一物种、同一生物体，也不相同；体现了基因的表达调控。二、基因组文库的构建构建基因组文库采取对庞大的DNA分子进行“各个击破”的策略；因此在对基因组DNA进行片段化时，应该得到一套相互重叠的片断；DNA的片断化方法：机械剪切和酶切法；机械法常用的是超声波法，好处是断裂随机，缺点是需要DNA量大；染色体DNA的制备和基因组文库的构建的基本程序制备基因组DNA的常用试剂破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎）除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、CTAB、苯酚）；除去RNA(RNaseA)除去黏多糖(CTAB);沉淀DNA（乙醇、异丙醇）；抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）；脱盐（70%乙醇漂洗）。通过限制酶进行片断化现在多用局部酶切法来进行；常选用一对4碱基识别酶（如HaeIII和AluI）；局部酶切(不完全酶切)得到的有代表性的产物片断末端为平端，连接效率低下，解决方法：加接头;或者选用产生粘性末端的酶；EcoRI甲基化酶对于构建好的文库，有多少个独立克隆才能保证目的基因出现在文库中呢？•(ClarkeandCarbon,1976:N:一个完整基因文库所应包含的重组转化子的克隆总数（库容量）；P:目的片段在文库的转化子中出现的几率，通常期望为99％（以保证文库中包含有任何一种DNA片段）；f:插入片段长度整个基因组总长度的比值。合格人基因组文库容量的估计人的基因组的大小为3×106kb，构建一个插入片段为1.5kb的基因组文库，需要分离和鉴定9×106个独立的克隆。难以出现在文库中的序列有的DNA序列的编码产物可能会对宿主有毒、或者干扰正常生命活动；重复序列可能会通过重排而丢失。三、RNA纯化方法及cDNA文库的构建研究RNA可以：确定RNA产物的相对丰度；确定基因转录的速率或者RNA加工的过程；RNA作图：3’、5’结构，内含子位置与大小；合成cDNAcDNA文库的构建cDNA文库是针对真核生物的；mRNA本身不可能被重组到载体中去；需要借助于逆转录酶转变成cDNA后才能重组；cDNA的合成步骤是文库构建过程的最重要步骤；1、真核生物RNA组成主要包括rRNA(80-85%),tRNA(15-20%),mRNA(1-5%);真核mRNA大多具有帽子与尾巴结构;由于RNA核糖环2’和3’具有羟基,化学性质不稳定(在碱性与高温下尤甚),并且RNase无处不在,又极难变性失活，因此，RNA的分离纯化对试验要求较高；RNA提取过程中需要特别注意创造一个无RNase（RNasefree）环境(内源与外源RNase的抑制、去除),以提取到“完整性”好的RNA。真核生物mRNA的结构2、提取RNA基本步骤总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等；裂解细胞：强离液剂：胍盐,SDS,N-laurylsarcosine(sarcosyl),尿素,苯酚；破坏质膜，保持细胞核或细胞器的完整性：如NonidetP-40(NP...