DNA文库的构建精VIP免费

第八章DNA文库的构建掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、cDNA文库构建的基本原理和操作技术；熟悉：cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成；教学目的一、基因文库某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。基因文库（genelibrary)：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。外源DNA片断、载体、宿主构建基因文库的基本程序：（1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA，（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA，（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌，（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因文库基因组DNA文库cDNA文库基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具有时空特异性。基因文库的应用：构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因二、基因组DNA文库的构建（一）基因组DNA文库的类型质粒文库，（﹤10kb)噬菌体文库，（0-23kb)粘粒文库，(~45kb)人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库，100kb—1Mb）（二）文库的代表性和随机性文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任何一段基因组DNA。一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和Carbon公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值例：哺乳动物基因组：3×109Kbp：=99%平均插入片段大小20kbf=20Kb/3×109KbN=ln（1-p）/ln（1-f）=690773.2（三）、基因组DNA文库的构建流程①载体的制备；②高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。基因组DNA文库的构建程序包含5个部分：1．基因组DNA文库的载体制备载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2．高质量大分子量基因组DNA的提取和部分酶切构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。实践表明，提取的基因组DNA分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。寻找最适的载体与基因组之间的比例。首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的DNA的转化效率也有所不同。3．文库的连接转化或包装侵染4．文库的质量检测克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。（四）、亚基因组文库例如：将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kb的Spel片段上则可将Spel酶切的基因组DNA中的8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。三、cDNA文库的构建1、cDNA文库的特征1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的发育时期或这一时期的特殊组织。根叶花花药茎穗下节幼胚GAmyb2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。3)mRNA的丰度高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22%中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49%低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%2、均一化cDNA文库通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。3、cDNA文库的构建第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离；第二，第一链cDNA合成；第...