生物大分子的分离纯化

生物大分子的分离纯化 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。 1 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的 pH值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴ 中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定 pH 值下易变的杂蛋白。 ⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用 PEG 聚乙二醇（Poly ethy ene gly col）作为沉淀剂。 1 .1 中盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA 和 rRNA 沉淀，而tRNA 保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活物质具有稳定作用。 ⑴ 中盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH ...