免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原一抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶一抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素一生物素一过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素一过氧化物酶（SP）法。PAP 法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成 PAP 复合物（含 3 个酶分子和 2 个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用 H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1 分子亲合素可结合 4 分子生物素，ABC 法即在此基础上建立。ABC 法与 PAP 法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成 ABC 复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入 ABC 复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入 DAB 进行显色。ABC 法的敏感性较 PAP 法更高。丿融 iAndi 胪 nO 生妁索 BiotaH 执生物索蛍白-的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做 IHC 的抗体，抗体说明书上必须有 IHC 测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。②二抗试剂盒目前本实验室所用二抗试剂盒为 LifeTechnologiesHistostain-PlusKit(HRP,BroadSpectrum)，货号 85-9043,—抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。③ DAB 试剂盒目前本实验室所用为加强型 DAB 显色试剂盒，货号 DAB-2032。④ 其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES 胶3. 抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须 Westernblot 验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。4. 耗材准备免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载...
