PCR及其衍生技术解析VIP免费

第十一章第十一章聚合酶链反应聚合酶链反应PCRPCR及其衍生技术及其衍生技术PCRPCR的用途的用途体外扩增特异体外扩增特异DNADNA片段片段的技术，能的技术，能快速快速、、特异特异地扩增目的地扩增目的DNADNA片段。片段。能通过试管内的数小时反应将特定的能通过试管内的数小时反应将特定的DNADNA片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出提出DNADNA双螺双螺旋结构及旋结构及半保留复制半保留复制模型。模型。19581958年，年，MeselsonMeselson和和StahlStahl用实验证实用实验证实DNADNA半保留复制模型。半保留复制模型。7070年代以来，人们采用两种思路去尝试建年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆基因克隆技技术，二是术，二是体外扩增体外扩增技术。技术。发展历程发展历程19711971年，年，KhoranaKhorana（美国（美国MITMIT教授，教授，19681968年诺贝尔医学奖得主）：“经过年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNADNA变性，变性，与合适引物杂交，用与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。”基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因核酸体外扩增最早设想被遗忘原因::（（11）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（（22））19701970年年SmithSmith等发现了等发现了IIII型限制性型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。内切酶，体外克隆基因已成为可能。19761976年，台湾省籍科学家钱嘉韵（年，台湾省籍科学家钱嘉韵（AliceAliceChienChien）从黄石国家公园的嗜热菌）从黄石国家公园的嗜热菌ThermusThermusaquaticusaquaticus中分离出热稳定的中分离出热稳定的TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶。。19851985年，美国年，美国CetusCetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的MullisMullis发明聚合酶链反应（发明聚合酶链反应（PolymerasePolymeraseChainReactionChainReaction，，PCRPCR），），SaikiSaiki等首次应等首次应用用PCRPCR法成功地扩增了人法成功地扩增了人--珠蛋白的珠蛋白的DNADNA，，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。19881988年年SaikiSaiki开始将开始将耐热性耐热性TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶应用于应用于PCRPCR，整个反应只加一次酶即可，，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。化。19891989年被誉为“分子年”，列年被誉为“分子年”，列PCRPCR为十余为十余项发明之首。项发明之首。19931993年，年，MullisMullis荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。PCRPCR的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的DNADNA复制反应，依据复制反应，依据①①DNADNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；②②体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可变性和复性变性和复性的性质；的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使•双链双链DNADNA变成单链变成单链，，①①单链单链DNADNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，，•DNADNA聚合酶使聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双引物沿着单链模板延伸为双链链DNADNA。。待扩增片段待扩增片段高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸PCRPCR每一步的转换通过每一步的转换通过温度的改变温度的改变控控制。制。DNADNA模板解链（模板解链（变性变性）、引物与模板）、引物与模板结合（结合（退火退火）、）、DNADNA聚合酶催化新生聚合酶催化新生DNADNA的合成（的合成（延伸延伸）三个步骤构成）三个步骤构成PCRPCR反应的一个循环。反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的此循环反复进行，可使目的DNADNA得以迅得以迅速扩增。速扩增。理论扩增率：理论扩增率：22nn递增递增（...