周俊宜周俊宜基础医学院生化教研室基础医学院生化教研室目录目录PCRPCR技术简史技术简史PCRPCR的原理的原理PCRPCR的反应体系和方法的反应体系和方法PCRPCR的类型和应用的类型和应用PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。•但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.MulliKaryB.Mulliss<>>>19891989年美国《年美国《ScienceScience》杂志列》杂志列PCRPCR为十余项重为十余项重大科学发明之首大科学发明之首,,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mul,Mullislis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。生物样品生物样品DNADNA片段片段基因诊基因诊断断基因治基因治疗疗基因工程产基因工程产品品法医学检法医学检测测人类学研人类学研究究…………基因组基因组DNADNA获取特定获取特定DNADNA片段片段扩增特定扩增特定DNADNA片片段段DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体SangerSanger的测序技的测序技术术引物DNADNA聚合酶聚合酶引物引物MullisMullis的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段9494℃变性变性50-65℃50-65℃退退火火XX℃延伸延伸9494℃55℃55℃37℃37℃TaqTaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性酶活性(%)(%)温度温度(℃)4050607080901001008060402072℃72℃9494℃55℃55℃PCRPCR循环循环PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PC...
