蛋白质的分离与纯化VIP免费

第九节蛋白质蛋白质的分离与纯化的分离与纯化一、引言二、蛋白质（酶）分离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离与纯化四、层析技术五、电泳技术六、离心技术四、层析技术•层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。•后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。•1944年出现纸层析。•以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。（一）层析的分类（一）层析的分类•按层析的分离机理分类•排阻层析(exclusionchromatography)•离子交换层析(ionexchangechromatography)•吸附层析(absorptionchromatography)•分配层析(partitionchromatography)•亲和层析(affinitychromatography)•金属螯合层析(metalchelatingchromatography)•疏水层析(hydrophobicchromatography)•反向层析(reversephasechromatography)•聚焦层析(focusingchromatography)•灌注层析(perfusionchromatography)（二）排阻层析（凝胶层析）（二）排阻层析（凝胶层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。11、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用•特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。•用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。22、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。3.3.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质(1)交联葡聚糖凝胶（Sephadex)1)SephadexGG后的数字为凝胶吸水值的10倍。G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。(2)琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。(3)聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶—P（Bio-GelP).(4)聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性品名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)4.4.层析柱的重要参数层析柱的重要参数•⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表...