第四十四章重组DNA技术提纲n重组DNA技术简介n基因克隆的详细步骤n基因克隆的应用n聚合酶链式反应n蛋白质工程n研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法n研究蛋白质之间相互作用的主要方法nSELEX技术n生物芯片技术n基因组编辑技术重组DNA重组DNA也称为基因克隆或分子克隆，是通过某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成嵌合体分子，并进行扩增和纯化以供进一步研究的技术。有效的基因克隆至少满足五个条件：（1）具有容纳外源基因或序列的载体；（2）具有将外源基因或序列导入载体的工具；（3）具有合适的宿主细胞；（4）具有将重组DNA引入到宿主细胞的途径；（5）具有选择和筛选重组体的方法。重组DNA技术的基本步骤基因克隆的载体载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的载体至少包括：①大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核系统中的扩增；②某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核细胞内的自主复制；③含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点，以方便各种克隆片段的插入和建立DNA文库；④带有抗生素抗性基因或其他选择性标记，有利于克隆的筛选和鉴别；⑤某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强子序列，有利于控制被插入的基因在转染细胞或转基因动物内的表达；⑥现代的载体一般含有多功能的结构元件，同时兼顾到克隆、DNA测序、体外突变、转录和自主复制。目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。pUC18/19质粒的基本结构λ噬菌体载体的构建、重组和包装细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入将外源基因或序列导入载体的工具将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸酶等。限制性内切酶限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4~6bp的回文序列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。已发现三类限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切割性质上有如下差别：1.Ⅰ类：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；2.Ⅱ类：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；3.Ⅲ类与Ⅰ类相似，需要Mg2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。II类限制性内切酶的三种切割方式黏端之间的退火宿主细胞宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒载体。将重组DNA引入到宿主细胞的途径1.转化2.转染3.电穿孔4.脂质体介导5.弹道基因转移重组体的选择和筛选直接筛选①根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选②根据营养需要进行筛选③根据噬菌斑类型进行筛选④蓝白斑选择间接筛选①核酸杂交法②PCR法③免疫化学④受体/配体的结合性质⑤Southwestern/Northwestern⑥DNA限制性内切酶图谱分析⑦DNA序列分析蓝白筛选法图解基因克隆的详细步骤1.获得外源DNA序列和目的基因；2.将目的基因与载体相连；3.将重组体导入特定的宿主细胞；4.目的基因序列克隆的筛选与鉴定。获取目的基因的手段1.人工合成2.使用酶切将目的基因直接从另一种克隆载体中释放出来3.反转录4.PCR目的基因与载体的连接将外源序列或目的基因插入载体，主要是靠DNA连接酶和其他工具酶的配合使用。根据...
