第四十四章重组DNA技术VIP免费

第四十四章重组DNA技术提纲n重组DNA技术简介n基因克隆的详细步骤n基因克隆的应用n聚合酶链式反应n蛋白质工程n研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法n研究蛋白质之间相互作用的主要方法nSELEX技术n生物芯片技术n基因组编辑技术重组DNA重组DNA也称为基因克隆或分子克隆，是通过某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成嵌合体分子，并进行扩增和纯化以供进一步研究的技术。有效的基因克隆至少满足五个条件：（1）具有容纳外源基因或序列的载体；（2）具有将外源基因或序列导入载体的工具；（3）具有合适的宿主细胞；（4）具有将重组DNA引入到宿主细胞的途径；（5）具有选择和筛选重组体的方法。重组DNA技术的基本步骤基因克隆的载体载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的载体至少包括：①大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核系统中的扩增；②某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核细胞内的自主复制；③含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点，以方便各种克隆片段的插入和建立DNA文库；④带有抗生素抗性基因或其他选择性标记，有利于克隆的筛选和鉴别；⑤某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强子序列，有利于控制被插入的基因在转染细胞或转基因动物内的表达；⑥现代的载体一般含有多功能的结构元件，同时兼顾到克隆、DNA测序、体外突变、转录和自主复制。目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。pUC18/19质粒的基本结构λ噬菌体载体的构建、重组和包装细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入将外源基因或序列导入载体的工具将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸酶等。限制性内切酶限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4~6bp的回文序列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。已发现三类限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切割性质上有如下差别：1.Ⅰ类：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；2.Ⅱ类：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；3.Ⅲ类与Ⅰ类相似，需要Mg2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。II类限制性内切酶的三种切割方式黏端之间的退火宿主细胞宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒载体。将重组DNA引入到宿主细胞的途径1.转化2.转染3.电穿孔4.脂质体介导5.弹道基因转移重组体的选择和筛选直接筛选①根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选②根据营养需要进行筛选③根据噬菌斑类型进行筛选④蓝白斑选择间接筛选①核酸杂交法②PCR法③免疫化学④受体/配体的结合性质⑤Southwestern/Northwestern⑥DNA限制性内切酶图谱分析⑦DNA序列分析蓝白筛选法图解基因克隆的详细步骤1.获得外源DNA序列和目的基因；2.将目的基因与载体相连；3.将重组体导入特定的宿主细胞；4.目的基因序列克隆的筛选与鉴定。获取目的基因的手段1.人工合成2.使用酶切将目的基因直接从另一种克隆载体中释放出来3.反转录4.PCR目的基因与载体的连接将外源序列或目的基因插入载体，主要是靠DNA连接酶和其他工具酶的配合使用。根据...