CAT测定方法

二、氧化氢酶的活性测定--高锰酸钾滴定法 [原理] 过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过 程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据 H202 的消耗量或O2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的 H2O2 溶液，经过酶 促 反 应 后 ， 用 标 准 高 锰 酸 钾 溶 液 ( 在 酸 性 条 件 下 ) 滴 定 多 余 的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 [仪器和用具] 研钵；三角瓶 50ml4 个；10ml 酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶 25ml1 个。 [试剂] 10％H2SO4； 0．2mol?L-1 磷酸缓冲液 pH7.8; 0．1mol?L-1 高锰酸钾标准液；称取KmnO4(AR)3.160 克，用新煮沸泠却的蒸馏水配制成 1000ml,用 0.1moL.L-1 草酸溶液标定； 0.1mol.l-1H2O2：市售 30％H202 大约等于 17．6m01?L-1，取 30％H202 溶液 5．68ml,稀释至于 1000ml,用标准 0.1molKMnO4 溶液（在酸性条件下）进行标定 0.1mol.L-1 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后，定容至1L。 [方法] 1．酶液提取：取小麦叶片2．5g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r?min-1离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2．取 50ml 三角瓶 4 个(2 个测定，2 个对照)，测定瓶中加入酶液 2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml0.1mol01?L-1H202，同时计时，于 30℃恒温水浴中保温 10min，立即加入 10％H2S042.5ml 3．用 0.1mol?L-1KMnO4 标准溶液滴定 H202，至出现粉红色(在 30min 内不消失)为终点。 4．结果计算：酶活性用每克鲜重样品 1min 内分解 H202 的毫克数表示： 酶活（mg.g-1.min-1）= 式中 A--对照KMn04 滴定毫升数(ml) B----酶反应后 KMnO4 滴定毫升数（ml） VT----酶液总量（ml）; V1----反应所用酶液量（ml） W-----样品鲜重（g） 1.7----1ml0.1mol.L-1 的 KMnO4 相当于 1.7mgH2O2. 注意 所用 KMnO4 溶液及 H2O2 溶液临用前要经过重新标定。 三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法 [原理] H202 在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性...