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ELISA试验技术要点

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酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA) 一、基本原理: 利用标记技术将酶标记到抗体(抗原)上,使待检物中相应的抗原(抗体)与酶标记抗体(抗原)发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时,酶能高效、专一催化、分解底物,生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅,可以判断待检物中有无特异的抗原(抗体)以及量的大小。该方法可对待测样品进行定性和定量分析,同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点,因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。 目前使用的酶联免疫检测方法很多,应用较多的有: 间接法——用于测定抗体 双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原 竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原 二、试验材料及试剂 酶标板(聚苯乙烯微量96 孔板) 包被液(0.05M pH9.6 碳酸盐冲液) 无水 Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水定容至 1000m l 洗涤液(0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液) NaCl 8.0g KCL 0.2g KH2PO4 0.2g Na2HPO4•12H2O 2.9g 吐温-20 0.5m l 蒸馏水加至 1000 m l 封闭液 明胶 1g 包被液 100m l 抗体稀释液 明胶 0.1g 洗涤液 100m l 底物缓冲液(pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液) 0.1M 柠檬酸 (19.2g/L) 24.3ml 0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml 蒸馏水 50ml TMB 底物使用液 TMB 储存液(100mg 溶于10mlDMSO,40C 保存) 0.1ml 底物缓冲液 10ml 30%H2O2 10ul 现用现配 终止液(2M H2SO4) H2SO4(96%) 22.2ml 蒸馏水 177.8ml 三、基本操作 1、 间接ELISA 操作步骤如下: 包被酶标板:加适度稀释的抗原,0.1ml/孔,4℃孵育过夜; 洗涤:倾去孔内的液体,在吸水纸上拍干,加入洗涤液,0.3ml/孔,洗涤三次,3min/次; 封闭:加入 1%明胶,0.2ml/孔; 37℃孵育 1h,洗涤同上 待检血清:加入适当稀释度的待测血清,0.1ml/孔; 37℃孵育 1h,洗涤同上 酶标记抗体:加入适当稀释度的酶标抗体,0.1ml/孔; 37℃孵育 1h,洗涤同上 底物:加入TMD 底物使用液,0.1ml/孔; 37℃孵育 15min 终止液:加入2M H2SO4,0.1ml/孔; 测定:终止后立即用酶标仪测定各孔OD 450nm。 2、 双抗体夹心 ELISA 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 包被酶标板:加适度稀释的抗体,0.1ml/孔,4℃孵育过夜; 洗涤:倾去孔内的液体,在吸水纸上拍干,加入洗涤液,0.3ml/孔,洗涤三次,3min/次;...

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