酶联免疫斑点技术介绍 一、 ELISPOT 技术概述 1 . 技术原理和技术特点 ELISPOT 全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA 技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。 该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的 ELISA 方法高 2-3 个数量级。其二，单细胞水平，活细胞功能检测。ELISPOT 检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。ELISPOT 没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。按照标准 化 的实验操作，一个实验者 可以同时 处 理数百个样 品 ，效 率 远 远 高于 其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。 实验设计 在 96 孔 培养板 上 进行，直 接 以培养板 的塑 料 板 底 或 者PVDF 膜 以及 硝酸 纤 维 素膜 为基 质 ，包 被上 特 异 性的单克 隆 抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。（由 于 涉 及 到 细胞培养的过程，对 单克 隆 抗体的要求 要远 高于ELISA 中的捕获抗体，该抗体需要无 毒 ，不含 内 毒 素，亲 和 力 高等 特 点。）之 后 ，在培养板 的孔内 加 入 细胞培养基 （现在无 血 清 ELISPOT 技术已 经成 熟 ，培养基 中可以不再 含有血 清 ）、待 检测的细胞以及 抗原刺激物进行培养。 在特 异 性的抗原或 者 非特 异 性的有丝 分裂 原的刺激下 ，数小 时 之 内 ，T 细胞就会开 始 分泌各 种 细胞因子。细胞因子当 即就被位于 细胞下 方的膜 上 的单克 隆 抗体所捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。每一个斑点就对应了当初一个分泌细胞因子的细胞，这些细胞被称为斑点形成细胞（Spots forming cells SFCs）。统计膜上的斑点...
